一种茶树病原真菌的特异性qPCR检测引物对、检测试剂盒及其应用

本发明属于植物病原真菌分子检测和茶树病害诊断，具体涉及以茶树病原真菌

sinodiscula theae-sinensis（以下简称st）为唯一直接检测对象的一对qpcr引物、包含所述引物对的检测试剂盒，以及利用所述引物对从茶树组织总dna中检测st特异性核酸信号的方法和应用。

背景技术：

1、茶树叶片可受到多种病原真菌侵染并形成斑点、坏死或扩展性病斑。

sinodiscula

theae-sinensis是茶树病斑组织中可检出的致病真菌之一，其在茶树组织中的存在情况需要通过病原分离或分子检测加以确认。然而，由于茶树病斑外观受到品种、叶龄、侵染时期、环境条件以及病斑中其他微生物组成等多种因素的影响，仅依据症状难以对st作出可靠鉴定。

2、现有对

sinodiscula theae-sinensis的鉴定通常可通过病斑组织分离培养、菌落及孢子形态观察，以及its或其他基因片段的pcr扩增和测序比对完成。上述方法能够用于菌株鉴定，但病原分离需要经过组织处理、培养、纯化和形态观察，周期较长；对于后期病斑、含菌量较低的样品或包含多种真菌的复杂样品，st还可能因分离效率、培养竞争或样品状态而难以稳定获得。采用its等通用或相对保守序列进行检测时，通常需要扩增、测序和数据库比对后才能确定目标真菌身份，通用引物获得的信号还可能来自样品中的其他真菌，因而不适合直接作为st特异性阳性判定依据。因此，对于不同病斑程度样品、不同地区样品以及人工接种材料的大批量筛查，亟需一种以st物种特异性序列为靶标、能够直接从茶树组织总dna背景中检出st的快速检测方法。

3、实时荧光定量pcr（qpcr）可根据目标序列设计特异性引物，并通过扩增曲线和熔解曲线获得检测结果，其关键在于选择能够区分st与茶树宿主及非目标真菌的特异性靶标。然而，目前尚未见针对

sinodiscula theae-sinensis的特异性qpcr检测方法的报道。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一对针对茶树病原真菌

sinodiscula theae-sinensis的qpcr引物，使其对能够扩增st候选特异性标记stsi002260，而在健康茶树dna和所测试的cc dna中不产生对应扩增信号，从而用于茶树组织中st的特异性检测。

2、

colletotrichum camelliae（以下简称cc）在本发明中仅作为非目标对照，用于验证所述引物对不发生cc dna交叉扩增，并非本发明的直接检测对象。

3、本发明可使待测样品在无需预先分离培养st的条件下即可进行st核酸信号筛查，并能够通过cc阴性对照证明所述引物对对两种真菌具有区分性。

4、为实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

5、本发明目的之一是提供一组用于特异性检测茶树病原真菌

sinodiscula theae-

sinensis的引物对，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.2~seq id no.3所示。

6、优选地，所述引物对以

sinodiscula theae-sinensis基因组中seq id no.1所示序列为检测靶标。

7、本发明目的之二是提供所述引物对在制备茶树病原真菌

sinodiscula theae-

sinensis特异性检测产品中的应用。

8、优选地，所述产品包括检测试剂和检测试剂盒。

9、本发明目的之三是提供一种用于特异性检测茶树病原真菌

sinodiscula theae-

sinensis的检测试剂盒，所述试剂盒中包括所述引物对。

10、优选地，所述试剂盒中还包括以下组分中的任意一种或多种：qpcr反应预混液、

sinodiscula theae-sinensis阳性对照dna、健康茶树阴性对照dna、

colletotrichum

camelliae非目标真菌对照dna、无核酸酶水。

11、本发明目的之四是提供一种利用所述引物对或所述试剂盒特异性检测茶树病原真菌

sinodiscula theae-sinensis的方法，其特征在于，包括以下步骤：

12、采集待测茶树组织，提取待测茶树组织总dna；

13、以所述待测总dna为模板，采用所述引物对进行实时荧光定量pcr扩增；

14、根据扩增曲线、ct值和熔解曲线判定待测样品中是否检出

sinodiscula theae-

sinensis特异性核酸信号。

15、优选地，所述实时荧光定量pcr扩增的反应体系中，所述引物对每条引物的终浓度均为0.1 μm~0.5 μm。

16、优选地，所述实时荧光定量pcr扩增的程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5~10s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环；反应结束后进行熔解曲线分析。

17、本发明目的之五是提供所述引物对或所述试剂盒在茶树病斑样品筛查、

sinodiscula theae-sinensis病原监测、人工接种验证或茶树抗病材料评价中的应用。

18、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

19、本发明的检测对象明确限定为

sinodiscula theae-sinensis，以st候选特异性标记stsi002260为扩增靶标。所述引物对在现有纯样品验证中扩增st dna，而不扩增健康茶树dna和

colletotrichum camelliaedna，可用于st与cc的检测区分。待测模板可直接来源于茶树病斑组织总dna，无需先从病斑中分离、纯化和培养st。所述引物对能够在轻微、轻度、中度和重度病斑样品中检出st特异性核酸信号，并可反映本批样品中该信号的相对变化。所述引物对在杭州、绍兴、诸暨和嵊州等不同来源样品中均获得检测信号，说明其具备用于不同地区茶树样品st筛查的应用潜力。所述引物对可作为st检测试剂盒的核心组分，用于st病原监测、人工接种验证和茶树抗病材料评价等。