引物探针组合在制备双重荧光定量PCR试剂盒的用途

本发明属于生物领域，具体涉及一种引物探针组合在制备双重荧光定量pcr试剂盒的用途。

背景技术：

1、鸡毒支原体（mycoplasma gallisepticum, mg）是引发鸡慢性呼吸道病的病原，能引起鸡咳嗽、流鼻液、呼吸道啰音，部分表现为结膜炎、眶下窦炎，常引发鸡群的群体发病，导致蛋鸡产蛋率下降，蛋的孵化率和饲料转化率变低，或使鸡群处于隐性感染而降低其抵抗力。mg广泛分布于所有养禽国家，可通过水平传播和垂直传播，且易与其他病原继发感染，造成大量鸡群死亡，给养禽业造成严重的经济损失。目前对于mg的防控主要通过药物预防和疫苗免疫。

2、关于mg的疫苗株的鉴定可见如下现有技术：

3、公开号为cn117904340a，主题为一种鉴别鸡毒支原体疫苗株的多重荧光pcr检测的引物探针组合、试剂盒及方法的专利申请；其公开了一种鉴别鸡毒支原体疫苗株的多重荧光pcr检测的引物探针组合，包括：用于鸡毒支原体ts-11、f、6/85和r疫苗株的引物探针。

4、公开号为cn120555626a，主题为一种鸡毒支原体荧光定量检测试剂盒及其应用的专利申请，其公开了一种鸡毒支原体荧光定量检测试剂盒及其应用。本发明的检测试剂盒包括荧光定量pcr反应液；荧光定量pcr反应液中包含用于检测鸡毒支原体野毒株的引物对和探针和用于检测鸡毒支原体mg6/85疫苗株的引物对和探针中的任意一组。本发明的检测试剂盒可以鉴别诊断鸡毒支原体野毒株和mg6/85疫苗株。

5、由此可见，在本领域中，通过荧光定量的方法鉴定疫苗株是一个常见的技术手段。

6、但是，基于snp位点进行相关鉴定工作的文献并不多。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种引物探针组合在制备双重荧光定量pcr试剂盒的用途，本发明筛选了mg的大量snp位点，最终筛选得到一个有价值的snp位点，并针对该位点进行了引物和探针的开发，最终得到符合要求的检测结果；

2、同时，本发明还提供了一种包含该引物和探针组合的试剂盒。

3、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

4、引物探针组合在制备用于区分鸡毒支原体ts11菌株与野生型菌株的双重荧光定量pcr试剂盒的用途；

5、所述引物探针组合包括第一引物、第二引物、第一探针、第二探针；

6、所述第一引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

7、所述第二引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

8、第一探针中的核苷酸序列如seq id no.3所示；

9、第二探针中的核苷酸序列如seq id no.4所示；

10、所述第一探针和第二探针具有不同的荧光基团。

11、mg基因组的基因长度为0.93mb-1.04mb；gc含量约31%；在自然界中，生物的dna/rna序列中每200bp就会存在一个snp位点突变；因此从鉴定微生物的角度来说，通过snp位点进行扩增并进行微生物区分有着一些困境，如snp位点过多，不同的基因型的微生物之间存在海量的snp位点需要比对；即使比对出一些理论可行的snp位点，也需要考虑其周围的gc含量，gc含量过低，也难于开发适配的引物和探针序列，此外在snp位点附近相同的核苷酸过多和连续出现容易发生引物自身二级结构或引物、探针间的二级结构产生，不利于引物设计，如图1至图3所示，图1展示的是274bp位置的snp突变，图2展示的是1513bp位置的snp突变，图3展示的是1802bp位置的snp突变；这三种情况都不利于引物设计。此外如图7所示的ts11基因组 60382bp位置的snp突变、如图8所示的ts11基因组 82288bp位置的snp突变、如图9所示的ts11基因组的207978 和 208054 bp位置的snp突变、如图10所示的ts11基因组的221286- 221464 bp位置的snp突变、如图11所示的ts11基因组的354520 bp位置的snp突变、如图12所示的ts11基因组的377532、377544、377601、377634、377660bp位置的snp突变；如图13所示的ts11基因组的605896 bp位置的snp突变、如图14所示的ts11基因组的892963-893175 bp位置的snp突变均因上述因素导致引物探针设计几乎不可能。

12、在本发明中，通过反复比对，我们从mg基因的157179和157182bp位置筛选得到2个有效的snp位点（具体可参考图15和图16），其满足区分ts11菌株和野生菌株的要求，同时其周围有合适的gc含量；基于此发现，提出本案。

13、更为具体来说，引物和探针的序列为：

14、上游引物f（第一引物）：5’- tagaacatatcttacacgcgacacttaaa-3’ (如seq idno.1所示);

15、下游引物r（第二引物）：5’- attacctggcgcattttggtt-3’ (如seq id no.2所示);

16、ts11菌株特异性荧光探针p-ts11（第一探针）：5’-fam- aatcagcggccaaa-mgb-3’(如seq id no.3所示);

17、野生型菌株的特异性荧光探针p-wt（第二探针）：5’-cy5- aatcagcagctaaag-mgb-3’ (如seq id no.4所示)。

18、在上述的用途中，所述第一探针和第二探针的3’端还结合有小沟结合物。

19、同时，本发明还公开了一种双重荧光定量pcr试剂盒，含有第一引物、第二引物、第一探针、第二探针；

20、所述第一引物的核苷酸序列如seq id no.1所示；

21、所述第二引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

22、第一探针中的核苷酸序列如seq id no.3所示；

23、第二探针中的核苷酸序列如seq id no.4所示；

24、所述第一探针和第二探针具有不同的荧光基团。

25、在上述的双重荧光定量pcr试剂盒中，所述试剂盒还包括：2×probe qpcrmastermix 5 μl、10 μmol/l上游引物0.3μl、10 μmol/l下游引物0.3μl、10 μmol/l第一探针0.2μl、10 μmol/l第二探针0.2μl、dna模板2μl、以及ddh2o 2.1μl。

26、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

27、本发明基于对于snp位点的筛选，建立的区分鸡毒支原体ts11菌株和野生型菌株的双重荧光定量pcr方法可以同时检测和鉴别鸡毒支原体ts11菌株和野生型菌株，具体操作简单、特异性强、重复性好等优点，不仅可以节约成本，还可以为判定活疫苗ts11菌株的定植效率和免疫后是否有野生型菌株的感染提供有效手段。

1.引物探针组合在制备用于区分鸡毒支原体ts11菌株与野生型菌株的双重荧光定量pcr试剂盒的用途；

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述第一探针和第二探针的3’端还结合有小沟结合物。

3.一种双重荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，含有第一引物、第二引物、第一探针、第二探针；

4.根据权利要求3所述的双重荧光定量pcr试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：2×probe qpcr mastermix 5 μl、10 μmol/l上游引物0.3μl、10 μmol/l下游引物0.3μl、10μmol/l第一探针0.2μl、10 μmol/l第二探针0.2μl、 dna模板2μl、以及ddh2o 2.1μl。