一种viralenhancinprotein基因及其引物探针组合和在肠炎沙门菌检测中的应用

本发明属于病原检测领域，具体涉及一种

viral enhancin protein基因及其引物探针组合和在肠炎沙门菌检测中的应用，特别在鉴别区分肠炎沙门菌与同属异种血清型沙门菌（如鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌）、其他菌株。

背景技术：

1、肠炎沙门菌是我国家禽养殖业中具有重大危害的细菌性传染病病原之一，其广泛流行对养殖业的生产效益和疫病防控构成严峻挑战。由于肠炎沙门菌具有较强的人兽共患潜力，可通过受污染的禽肉及蛋制品等食品链环节进行传播，人类经摄入被污染食品后易引发急性肠胃炎，表现为发热、腹痛、腹泻等症状，严重时可导致菌血症或继发感染，对公共卫生安全构成持续威胁。因此，该病原的监测、源头控制与综合防控已成为保障畜禽健康、维护食品安全及降低人畜共患病风险的重要方向。

2、基于实时荧光定量聚合酶链反应（qpcr）技术的快速发展，taqman探针法因其高特异性、高灵敏度及可准确定量的特点，被广泛应用于病原微生物的检测与鉴定。该方法通过在上下游引物之间引入一段与目标序列互补的寡核苷酸探针，探针5'端标记荧光报告基团，3'端标记淬灭基团，在pcr扩增过程中，dna聚合酶发挥5'→3'外切酶活性将探针降解，使荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生可检测的荧光信号。该信号强度与扩增产物的量呈正相关，因此可在反应周期内实现目标核酸的实时监测与定量分析。taqman探针技术已广泛用于食源性致病菌、人畜共患病原及环境微生物的检测，并在临床诊断、食品安全监控及流行病学调查中发挥着重要作用。但是，由于肠炎沙门菌与其他沙门菌血清型基因相似度极高，探针设计稍有不慎就会产生“假阳性”。

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提供一种

viral enhancin protein基因及其引物探针组合和在肠炎沙门菌检测中的应用。

2、技术方案：本发明提供一种

viral enhancin protein基因，其核苷酸序列如seqid no.2所示。

3、本发明还提供一种所述基因编码的蛋白。

4、本发明还提供一种重组载体或重组菌，其含有所述基因。

5、本发明还提供一种引物对和探针组合，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

6、本发明还提供一种检测试剂或试剂盒，其含有所述引物对和探针组合。

7、其中，所述试剂盒为pcr检测试剂盒。

8、其中，所述试剂盒包括实时荧光定量pcr试剂盒。

9、本发明还提供所述引物对和探针组合或所述检测试剂或试剂盒在检测样品中肠炎沙门菌的应用。

10、本发明还提供所述

viral enhancin protein基因在检测样品中肠炎沙门菌的应用。

11、本发明还提供一种检测肠炎沙门菌的方法，包括以下步骤：

12、（1）以样本dna为模板，利用权利要求1所述引物对和探针组合进行实时荧光定量pcr检测；

13、（2）当样品检测出现ct值代入标准曲线计算，当计算值≥2.5×102 cfu时，即可判定样品中存在沙门菌。

14、其中，所述标准曲线为y=-4.808x+49.84，其中x为细菌数，cfu/ml；y为ct值。

15、本发明中的一种基于肠炎沙门菌（

salmonella enterica serovar enteritidis）的

viral enhancin protein基因。通过多个菌株基因组比对筛选出肠炎沙门菌

viral

enhancin protein基因，基于taqman探针设计标准，从

viral enhancin

protein基因编码序列中筛选出合适的探针序列，并基于该序列的上、下游序列设计特异性引物。通过常规聚合酶链式反应（pcr）与实时荧光定量pcr（qpcr），验证引物与探针组合的特异性，确保引物和探针在目的基因上的专一识别。在此基础上，构建taqman探针的标准曲线，并对探针的检测限进行评估。研究结果表明，特异性引物与taqman探针均具有较高的特异性，标准曲线拟合方程为y=-4.808*x+49.84。使用提取的肠炎沙门菌c50041细菌基因组作为模板（洗脱液体积为60 μl），该检测方法的检测限为2.5×102 cfu/μl。具体包括：

16、（1）通过多基因组序列比对筛选出肠炎沙门菌特异性基因

viral enhancin

protein；

17、（2）验证引物与探针的特异性；

18、（3）建立taqman探针的标准曲线；

19、（4）检测taqman探针的检测限；

20、（5）检测肠炎沙门菌在肉鸡脏器的定殖。

21、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：（1）无需经过复杂的分菌、生化鉴定及血清学鉴定即可区分出肠炎沙门菌，极大缩短病原检测时间。（2）与传统方法相比，实验条件要求低，可对病原进行定量检测。

1.一种viral enhancin protein基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.一种权利要求1所述基因编码的蛋白。

3.一种重组载体或重组菌，其特征在于，其含有权利要求1所述viral enhancin protein基因或权利要求2所述蛋白。

4.一种引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

5.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求4所述引物对和探针组合。

6.根据权利要求5所述检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为pcr检测试剂盒。

7.根据权利要求5所述检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括实时荧光定量pcr试剂盒。

8.权利要求1所述viral enhancin protein基因在检测样品中肠炎沙门菌的应用。

9.权利要求4所述引物对和探针组合或权利要求5~7任一项所述检测试剂或试剂盒在检测样品中肠炎沙门菌的应用。

10.一种检测肠炎沙门菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：