IL31-VLP及其医疗用途的制作方法

本发明涉及病毒样颗粒(vlp)，其通过高亲和力和通用的蛋白质附着系统（该系统允许vlp的模块化、可互换的修饰）被il31多肽或其功能性片段修饰(il31-vlp)和任选地另外的功能性分子修饰。本发明还涉及生产il31-vlp的方法，包括在单细胞内进行的生产方法，以及il31-vlp在研究、诊断和作为药物如疫苗用于预防和/或治疗疾病中的用途。

背景技术：

1、病毒样颗粒(vlp)

2、病毒样颗粒(vlp)是与病毒非常相似但不含病毒遗传物质的分子。它们由病毒结构蛋白如病毒衣壳蛋白形成，当单独表达时，病毒衣壳蛋白自组装成颗粒。大多数vlp看起来像中空的“纳米足球”，其中足球的整个表面由单个自组装蛋白质的许多拷贝组成。就生产目的而言，这意味着生产一个单一的蛋白质就足以生成大的纳米足球型vlp结构。

3、这已在医学上得到利用。vlp最常见的用途是作为疫苗。这背后的基本机制是，哺乳动物已经进化出免疫感应机制，将病毒衣壳上发现的高度重复模式识别为入侵者。这些模式仍然存在于vlp中，vlp包含重复的、高密度的病毒表面蛋白展示，但是去除了有害的病毒基因组。这是vlp用作针对引起宫颈癌的人乳头瘤病毒(hpv)的疫苗的形式。目前市面上有这种类型的hpv疫苗可供选择，如glaxosmithkline的cervarix和merck & co生产的gardasil和gardasil-9。

4、用作疫苗的vlp的进一步开发包括将其他因子(agent)与vlp外壳结合。在这种情况下，vlp外壳将额外的因子作为“表位”呈递给免疫系统。在一些情况下，形成vlp外壳的病毒衣壳蛋白可以被修饰以通过基因融合直接并入用于展示的表位。然而，这种方法通常导致vlp组装受损，大蛋白通常导致vlp不稳定。此外，如果该因子不是基于蛋白质的，则不能使用这种方法。正在开发的某些covid19疫苗使用这种形式的vlp，其中来自冠状病毒的刺突蛋白直接融合到病毒衣壳蛋白，形成来自无关病毒的vlp外壳。

5、vlp附着手段

6、另一种选择是组装vlp，然后使用附着手段将该因子固定到vlp外壳上。这种使用额外附着手段的vlp可以被称为“复合vlp”。复合vlp可通过诸如化学交联、反应性非天然氨基酸或使用结合蛋白（如spytag/spycatcher系统）的方法来制造，以将所需因子共价附着到形成外壳的病毒衣壳蛋白上。

7、后一种方法允许将其他非蛋白表位附着到vlp上，但是需要复杂的生产工艺，并且还不能用于任何因子。此外，一些所需的蛋白质太大，以至于不能使用现有的附着手段附着到vlp外壳上，而一些复杂的表位包括具有许多必须单独连接在一起的组分的多聚体，这需要多个化学交联步骤来实现。

8、目前用作附着手段的结合蛋白，例如在spytag/spycatcher系统中，具有进一步的问题，即蛋白质之间的结合虽然很强，但需要形成共价键，因此不会立即发生，而是需要时间使反应物融合，并且会导致vlp外壳聚集，这取决于哪种因子附着到外壳上。此外，使用spytag/spycatcher作为融合配偶体(partner)并不能同时提供有效的分子伴侣结构域来帮助所融合的目的蛋白的正确折叠。

9、对于人类或兽医临床应用中使用的vlp，监管机构将vlp归类为“生物”活性药物中间体(adi)。“生物”药物是在活细胞中生产的，然后根据监管机构批准的工艺进行纯化。用于生产的每种细胞系（无论是细菌/植物/酵母/昆虫/哺乳动物）都经过详细表征，以保证adi的长期稳定性，并作为所谓的“主细胞库”(mcb)在高度指定的条件下储存。如果vlp需要两种（或甚至更多种）蛋白质来组装，例如当蛋白质用于将表位附着到vlp外壳时，那么目前药物的每种蛋白质组分需要一种mcb，并且两者都需要单独的纯化工艺，每种都需要单独的表征程序，因为两者都被归类为“关键药物中间体”。此外，每种关键药物中间体以及最终adi都需要单独的质量控制放行，这增加了制造成本。

10、除了这些复杂性之外，对于每个表位，必须从头开始建立表位的生产。从经济上来说，最有效的生产细胞类型是细菌，并且最常见的是大肠杆菌。然而，当在大肠杆菌中生产时，许多蛋白质并不呈现它们的天然形状，而是必须作为纯化工艺的一部分从变性状态重新折叠成它们的正确形式，这导致总产率的巨大下降并显著增加了工艺复杂性。

11、由于所有这些缺点，试图将诸如表位之类的因子附着到病毒衣壳蛋白上的复合vlp型药物的生产工艺复杂且昂贵。这限制了对vlp应用的广泛探索，使其局限于那些廉价的大规模生产可以使其更具竞争力的领域。因此，这也限制了基于vlp的il31应用的探索，例如基于vlp的il31疫苗。

12、il31及其在基于vlp的疫苗中用于治疗瘙痒病况的用途

13、il31是造成瘙痒的关键细胞因子，并且与多种炎症性皮肤病况（如特应性皮炎，其可以是慢性的和衰弱性的）有关。因此，il31疫苗和抗il31抗体已被建议作为治疗瘙痒相关病况的疗法(bachman等人, 2018)。然而，有效的il31疫苗尚未开发出来。

14、针对犬il31的基于vlp的疫苗已被尝试用于治疗狗的特应性皮炎，其中巯基(sh)基团被引入到il31中，然后使用琥珀酰亚胺基6-((β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(smph)将il31化学交联到源自含有通用t细胞表位的黄瓜花叶病毒的vlp上的表面赖氨酸上(bachman等人, 2018)。

15、马il31同样使用smph交联到源自含有破伤风类毒素通用t细胞表位的黄瓜花叶病毒的vlp上，其也已被用作针对马的昆虫叮咬过敏症的疫苗，昆虫叮咬过敏症是昆虫叮咬后发生的常见季节性瘙痒性过敏性皮炎(olomski等人, 2019)。

16、虽然如bachman等人(2018)和olomski等人(2019)所述，可以将il31化学交联到vlp上，这可以克服vlp组装受损或vlp不稳定性的任何问题，但这种交联技术仍然存在上述缺点，即必须使用单独的细胞系来产生待交联的单独组分（例如vlp外壳和il31多肽）。如上所述，目前的基于il31-vlp的结构具有为每个组成部分建立单独生产工艺然后偶联到vlp中的高负担，经常导致il31蛋白的不正确折叠，特别是当在通常用于蛋白质生产的细菌宿主中表达时，面临潜在的vlp外壳聚集以及通过多步交联工艺进行的多聚体蛋白的繁琐组装的问题。

17、使用细菌毒素和抑制剂对将il31偶联到vlp上

18、因此，希望提供具有展示功能性分子如il31的模块化能力的复合vlp，所述功能性分子包括非蛋白质、在大肠杆菌内难以折叠的蛋白质以及复杂且大的蛋白质如多聚体。还希望通过更简单的工艺生产这种复合vlp，该工艺只需要使用一种细胞系，并且其中vlp外壳和待展示的因子可以在细胞系内自组装，理想地没有vlp外壳聚集。这些特征中的一些可以通过使用细菌毒素和抑制剂蛋白结合对将所需的功能性分子如表位附着到vlp上来提供（如wo/2022/112790中所述）。本质上，该技术基于包含细菌毒素及其抑制剂的结合蛋白对，其中一个附着于vlp外壳，例如乙型肝炎病毒衣壳(hbc)蛋白，另一个附着于所需的因子，例如il31，因此该因子可以通过细菌毒素与其抑制剂的结合而附着于vlp外壳。

19、然而，即使使用这种技术，特定的所需功能性分子如il31与这种模块化形式vlp的结合蛋白（如细菌毒素或其抑制剂）的附着也带来了不可预测的融合蛋白行为的问题。

20、希望提供一种模块化形式vlp结构的优化版本，其被专门设计用于表达il31，il31是许多免疫疾病中的关键介质。

21、本发明的一个或多个方面旨在解决一个或多个上述问题。

技术实现思路

1、在本发明的第一方面中，提供了一种病毒样颗粒(vlp)，其包含：

2、-一个或多个病毒衣壳蛋白；

3、-一个或多个结合蛋白对，每个结合蛋白对包含第一结合蛋白和第二结合蛋白，其中所述结合蛋白对包含细菌毒素及其抑制剂，

4、-一个或多个功能性分子，其中至少一个功能性分子是il31多肽或其功能性片段，

5、其中每个病毒衣壳蛋白附着于第一结合蛋白，其中每个功能性分子通过接头附着于第二结合蛋白，并且其中所述第一结合蛋白和第二结合蛋白能够彼此结合。

6、在一个实施方案中，所述一个或多个病毒衣壳蛋白是同源二聚体蛋白。

7、在一个实施方案中，所述il31多肽或其功能性片段是人il31或其功能性片段，合适地其中所述il31多肽或其功能性片段是人il31或其功能性片段，合适地其中所述il31多肽包含与seq id no: 11或12具有70%或更高同一性的序列。

8、在一个实施方案中，每个接头包含至少8个氨基酸，合适地8至30个氨基酸，合适地8个氨基酸、24个氨基酸或28个氨基酸。

9、在一个实施方案中，所述接头是结构无序的或柔性的。

10、在一个实施方案中，所述接头包含至少一个富含甘氨酸和丝氨酸残基的区域，任选地其中大多数残基是甘氨酸和丝氨酸，进一步任选地由甘氨酸和丝氨酸残基组成。

11、在另一个实施方案中，所述接头包含一个以上这样的区域，合适地，所述接头包含富含甘氨酸和丝氨酸残基的第一区域和第二区域，任选地其中大多数残基是甘氨酸和丝氨酸，进一步任选地由甘氨酸和丝氨酸残基组成。

12、在另一个实施方案中，所述接头进一步包含第三区域，任选地切割位点，进一步任选地蛋白酶切割位点，再进一步任选地tev蛋白酶切割位点，其具有根据seq id no: 52的序列。

13、在另一个实施方案中，所述接头从n至c末端包含以下结构：第一区域、第三区域和第二区域。

14、在另一个实施方案中，富含甘氨酸和丝氨酸残基的所述区域或每个区域包含选自seq id no: 4、seq id no: 6、seq id no: 7和seq id no: 8的序列，合适地选自seq idno: 4、7或8的序列。

15、在另一个实施方案中，所述接头包含与seq id no: 4、seq id no: 33或seq idno: 34具有70%或更高同一性的序列。

16、在一个实施方案中，所述第一结合蛋白是细菌毒素抑制剂，并且所述第二结合蛋白是细菌毒素。

17、在一个实施方案中，所述细菌毒素抑制剂选自im7、im8、im9、im2和barstar。

18、在一个实施方案中，所述细菌毒素是细菌核酸酶，任选地所述细菌核酸酶选自：cole7、cole8、cole9、cole2和barnase。

19、在一个实施方案中，所述细菌毒素及其抑制剂是cole7和im7，任选地，im7的氨基酸序列包含以seq id no: 78为参考的以下取代：f41l，和/或cole7的氨基酸序列包含以seq id no: 41为参考的一个或多个以下取代：arg538ala、glu542ala和his569ala，合适地，其中im7包含与seq id no: 36具有70%或更高同一性的序列，和/或其中cole7包含与idno: 1具有70%或更高同一性的序列。

20、在一个实施方案中，所述病毒衣壳蛋白是乙型肝炎衣壳(hbc)蛋白，任选地与seqid no: 42具有70%或更高同一性的乙型肝炎衣壳(hbc)蛋白。

21、在一个实施方案中，将第一结合蛋白插入乙型肝炎衣壳蛋白的主要免疫显性区域，合适地所述区域位于seq id no: 42的氨基酸75至81之间，任选地将第一结合蛋白插入根据seq id no: 42的乙型肝炎衣壳蛋白的主要免疫显性区域的氨基酸残基76和80之间。

22、在一个实施方案中，所述乙型肝炎衣壳蛋白包含以seq id no: 42为参考具有以下氨基酸缺失的氨基酸序列：e77和d78。

23、合适地，其中所述乙型肝炎衣壳蛋白包含根据seq id no: 35的序列。

24、在一个实施方案中，所述vlp进一步包含二级接头，合适地，其中每个病毒衣壳蛋白通过二级接头附着于第一结合蛋白，合适地，其中所述二级接头包含根据seq id no: 13的序列。

25、在一个实施方案中，附着于第一结合蛋白的每个病毒衣壳蛋白包含与seq id no:3具有至少70%同一性的序列。

26、在一个实施方案中，所述第一结合蛋白包含化学修饰，任选地所述化学修饰附着于另外的功能性分子。在一个实施方案中，所述化学修饰是具有胺基的烷烃，任选地具有胺基的1-10个碳的烷烃，任选地所述化学修饰选自deae或辛胺。

27、在一个实施方案中，所述一个或多个另外的功能性分子可以相同或不同，任选地每个功能性分子选自：蛋白质抗原或非蛋白质抗原或其表位、抗原结合蛋白或荧光分子。

28、在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白选自抗体或其结合片段、抗体模拟物和适体，任选地所述抗原结合蛋白是抗体，进一步任选地是能够结合目的抗原的抗体。

29、在一个实施方案中，所述非蛋白质抗原选自：糖、脂质、碳水化合物或小分子化学品。

30、在一个实施方案中，所述蛋白质抗原源自感染因子，任选地所述蛋白质抗原源自病毒、细菌、真菌、原生动物、古细菌，任选地所述蛋白质抗原源自病毒，进一步任选地所述病毒选自：腺相关病毒、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)、克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congo hemorrhagic fever virus)、登革热病毒(dengue virus)、埃博拉病毒(ebolavirus)、埃可病毒(echovirus)、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)、汉坦病毒(hantaan virus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒、人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人副流感病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、日本脑炎病毒、多瘤病毒、昆津病毒(kunjin virus)、拉沙病毒(lassa virus)、麻疹病毒、传染性软疣病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(nipah virus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、a类轮状病毒、b类轮状病毒、c类轮状病毒、风疹病毒、鹭山病毒(sagiyama virus)、salivirus a、札幌病毒(sapporo virus)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、托斯卡纳病毒(toscana virus)、乌库涅米病毒(uukuniemi virus)、水痘-带状疱疹病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡性口炎病毒、西部马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒、寨卡病毒(zika virus)，更进一步任选地，所述蛋白质抗原源自冠状病毒，更进一步任选地源自sars-cov-2，更进一步任选地所述蛋白质抗原是源自sars-cov-2的刺突蛋白的全部或部分，或者是源自sars-cov-2的核衣壳蛋白的全部或部分。

31、在一个实施方案中，所述蛋白质抗原源自非感染因子，任选地所述蛋白质抗原源自炎性分子、引起神经、软骨或骨组织退行性变化的分子或引起肿瘤疾病恶化的分子，进一步任选地所述蛋白质抗原是选自趋化因子、细胞因子或蛋白酶的炎性分子，更进一步任选地所述蛋白质抗原选自：il1、il2、il3、il4、il5、il6、il7、il8、il9、il10、il11、il12、il13、il17、il31、il33、tnfα、tnfβ、ifnα、ifnβ、ifnγ、g-csf、gm-csf、m-csf、促红细胞生成素和tgfβ，更进一步任选地所述蛋白质抗原是il13、il17或il33的全部或部分。

32、在一个实施方案中，所述荧光分子选自：gfp、ebfp、ebfp2、azurite、gfpuv、t-saphhire、cerulean、cfp、mcfp、mturquoise2、cypet、mkeima-red、tagcfp、amcyan1、mtfp1、midoriishi cyan、turbogfp、taggfp、emerald、azami green、zsgreen1、yfp、tagyfp、eyfp、topaz、venus、mctrine、ypet、turboyfp、zsyellow1、kusabira orange、morange、别藻蓝蛋白、mko、rfp、turborfp、tdtomato、tagrfp、dsred、mstrawberry、turbofp602、asred2、j-red、r-藻红蛋白、b-藻红蛋白、mcherry、hcred、katusha、p3、多甲藻黄素-叶绿素(peridinchlorophyll)、mkate、turbofp635、mplum、mraspberry，任选地所述荧光分子是gfp。

33、在一个实施方案中，每个功能性分子是il31多肽或其功能性片段。

34、在第二方面中，提供了一种功能性融合蛋白，其包含通过接头与结合蛋白融合的il31多肽或其功能性片段，其中所述结合蛋白是细菌毒素。

35、与第一方面相关的任何实施方案同样适用于第二方面。

36、在一个实施方案中，所述功能性融合蛋白进一步包含亲和纯化标签。

37、在一个实施方案中，所述功能性融合蛋白包含与seq id no: 43、44、45、46、47、48、49或50具有至少70%同一性的序列。在一个实施方案中，所述功能性融合蛋白包含与seqid no: 47、48或49具有至少70%同一性的序列。

38、在第三方面中，提供了编码根据本发明第二方面的功能性融合蛋白的一个或多个核酸。合适地，其中所述核酸包含与seq id no: 59-66具有至少70%同一性的序列，合适地，其中所述核酸包含与seq id no: 63、64或65具有至少70%同一性的序列。

39、在第四方面中，提供了包含本发明第三方面的一个或多个核酸的一个或多个载体。合适地，其中所述载体包含与seq id no: 27-32、57或58具有至少70%同一性的序列，合适地，其中所述载体包含与seq id no: 31、32或57具有至少70%同一性的序列。

40、在第五方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本发明第三方面的一个或多个核酸，或本发明第四方面的一个或多个载体。

41、在第六方面中，提供了包含一个或多个载体的宿主细胞，所述一个或多个载体包含编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸，和编码通过接头附着于第二结合蛋白的il31多肽或其功能性片段的第二核酸；其中第一结合蛋白和第二结合蛋白能够彼此结合。

42、在一个实施方案中，所述第一核酸选自与seq id no: 16具有至少70%同一性的序列，并且所述第二核酸选自与seq id no: 59-66具有至少70%同一性的序列。合适地，其中所述第二核酸选自与seq id no: 63、64或65具有至少70%同一性的序列。

43、在第七方面中，提供了一种在单一宿主细胞中生产病毒样颗粒(vlp)的方法，其包括：

44、(a)提供包含一个或多个载体的宿主细胞，其中所述一个或多个载体包含：

45、(i)第一核酸，其编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白；和

46、(ii)第二核酸，其编码通过接头附着于第二结合蛋白的il31多肽或其功能性片段；

47、(b)在适于从第一核酸和第二核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞；

48、(c)从蛋白质形成vlp。

49、在一个实施方案中，所述方法进一步包括回收病毒样颗粒(vlp)的步骤，和任选地配制vlp的步骤。

50、在第八方面中，提供了一种生产病毒样颗粒(vlp)的方法，其包括：

51、(a)提供包含一个或多个载体的第一宿主细胞，其中所述一个或多个载体包含编码附着于第一结合蛋白的病毒衣壳蛋白的第一核酸；

52、(b)提供包含一个或多个载体的至少一个另外的宿主细胞，其中所述一个或多个载体包含编码通过接头附着于第二结合蛋白的il31多肽或其功能性片段的第二核酸；

53、(c)在适于从第一核酸和第二核酸表达蛋白质的条件下培养宿主细胞；

54、(d)回收蛋白质；

55、(e)混合蛋白质以形成病毒样颗粒。

56、在一个实施方案中，所述方法进一步包括回收病毒样颗粒(vlp)的步骤，和任选地配制vlp的步骤。

57、在第九方面中，提供了一种包含根据本发明第一方面的vlp的免疫原性组合物。

58、在第十方面中，提供了根据本发明第一方面的vlp或根据本发明第九方面的免疫原性组合物，其用作药物，任选地其中所述药物是疫苗。

59、在第十一方面中，提供了根据本发明第一方面的vlp或根据本发明第九方面的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗il31介导的病况，合适地预防和/或治疗免疫介导的病况。例如皮肤病况、过敏性病状和肿瘤血液病况，任选地其中所述皮肤病况涉及瘙痒，进一步任选地其中涉及瘙痒的皮肤病况是皮炎。

60、在第十二方面中，提供了根据本发明第一方面的vlp或根据本发明第九方面的免疫原性组合物，其用于研究或疾病诊断。

61、在第十三方面中，提供了一种产生il31抗体的方法，所述方法包括在动物免疫中使用根据本发明第一方面的vlp或根据本发明第九方面的免疫原性组合物来产生抗il31抗体，并回收所述抗体，任选地进一步配制回收的抗体。

62、本发明的益处

63、本发明提供了许多优于现有技术的显著益处。

64、本发明提供了一种特定的结构，其中il31多肽或其功能性片段通过接头与病毒样颗粒(vlp)上的一对细菌毒素-抑制剂结合蛋白连接。本发明人已经发现，接头的使用使得先前显示的毒素/抑制剂对的融合的实际可用性显著增加，从而能够简化修饰的vlp的生产。本发明人已经发现，用于将il31多肽或其功能性片段附着于细菌毒素或其抑制剂的接头可以被调整和优化，使得长度、柔性和序列同一性的特性允许有效表达，并且重要的是还允许所述蛋白质的正确翻译后折叠。

65、此外，本发明提供了能够使用也存在于融合蛋白上的亲和标签（例如多聚组氨酸标签）有效纯化包含il31或其功能性片段和细菌毒素（例如cole7）或其抑制剂（例如lm7）的功能性融合蛋白的益处。这借助于所述融合蛋白能够有效地结合用于纯化所述亲和标签的相应材料（例如固定的金属，如ni2+或co2+）。有利地，所述接头不会在空间上阻碍存在于所述融合蛋白上的亲和标签与其亲和配偶体结合。

66、因此，本发明提供了一种更有效的生产vlp的方法，所述方法通过在结构中使用合适的接头来展示il31或其具有正确天然折叠的功能性片段，从而开启了这种vlp的商业可行生产的可能性，所述vlp用作治疗一系列il31介导的疾病的疫苗。如上所述，这类疾病范围广泛，可对人类和动物都非常有害，因此至今还没有针对il31的潜在致病因子的合适治疗方法。

67、上述方面的特征和实施方案将在下面的标题部分中进一步描述。任何特征或实施方案可以以任何可行的组合与任何方面相结合。

68、虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方案的产生和使用，但是应该理解，本发明提供了许多可应用的发明概念，这些概念可以在各种各样的具体环境中实施。本文讨论的具体实施方案仅仅是产生和使用本发明的具体方式的说明，并不限制本发明的范围。

69、为了便于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语诸如“一个”、“一种”和“该”不旨在仅指单个实体，而是包括可以使用特定实例进行说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的使用不限制本发明，除非在权利要求中作为概述。

70、本文对本发明背景的讨论被包括在内以解释本发明的上下文。这并不意味着承认所提及的任何材料在任何国家在任何权利要求的优先权日之前都是公开的、已知的或者是公知常识的一部分。

71、除非另有说明，本发明将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如，current protocols in molecular biology (ausubel,2000, wiley and son inc, library of congress, usa)；molecular cloning: alaboratory manual, 第三版, (sambrook等人, 2001, cold spring harbor, new york:cold spring harbor laboratory press)；oligonucleotide synthesis (m. j. gait编,1984)；美国专利号4,683,195；nucleic acid hybridization (harries and higginseds. 1984)；transcription and translation (hames和higgins编, 1984)；culture ofanimal cells (freshney, alan r. liss, inc., 1987)；immobilized cells andenzymes (irl press, 1986)；perbal, a practical guide to molecular cloning(1984)；丛刊, methods in enzymology (abelson和simon主编, academic press, inc.,new york)，特别是第154卷和第155卷(wu等人编)以及第185卷, “gene expressiontechnology” (goeddel编)；gene transfer vectors for mammalian cells (miller和calos编, 1987, cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in celland molecular biology (mayer和walker编, academic press, london, 1987)；handbook of experimental immunology, vols. i-iv (weir和blackwell编, 1986)；和manipulating the mouse embryo, (cold spring harbor laboratory press, coldspring harbor, n.y., 1986)。

72、术语“同一性”和“相同的”等指两个聚合分子之间的序列相似性，例如两个核酸分子之间，如两个dna分子之间，或两个蛋白质分子之间。合适地，本文的任何核酸分子或蛋白质分子可与本文的seq id鉴定的任何给定参考序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的同一性。序列比对和序列同一性的确定可以通过，例如，使用最初由altschul等人1990 (j mol biol 215: 403-10)描述的基本局部比对搜索工具(blast)，如由tatusova和madden 1999 (fems microbiollett 174: 247-250)描述的“blast 2序列”算法来完成。

73、比对序列进行比较的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法描述于，例如：smith和waterman (1981) adv. appl. math. 2:482；needleman和wunsch (1970) j.mol. biol. 48:443；pearson和lipman (1988) proc. natl. acad. sci. u.s.a. 85:2444；higgins和sharp (1988) gene 73:237-44；higgins和sharp (1989) cabios 5:151-3; corpet等人(1988) nucleic acids res. 16:10881-90；huang等人(1992) comp.appl. biosci. 8:155-65；pearson等人(1994) methods mol. biol. 24:307-31；tatiana等人(1999) fems microbiol. lett. 174:247-50。可以在例如altschul等人(1990) j.mol. biol. 215:403-10中发现序列比对方法和同源性计算的详细考虑。

74、美国国家生物技术信息中心(ncbi)基本局部比对搜索工具(blast™；altschul等人(1990))可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(bethesda，md)和互联网，用于与几个序列分析程序结合。关于如何使用该程序确定序列同一性的说明可在互联网上blast™的“帮助”部分找到。为了比较核酸序列，可以使用blast™ (blastn)程序的“blast2序列”功能，使用默认参数。当用这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示出增加的同一性百分比。通常，序列同一性百分比是在整个序列长度上计算的。

75、例如，合适地，使用以下评分参数，通过needleman-wunsch算法找到全局最佳比对：匹配得分：+2，错配得分：-3；空位罚分：空位开放5，空位延伸2。合适地，所得最佳全局比对的同一性百分比可通过比对碱基数与总比对长度的比值乘以100来计算，其中比对长度包括匹配和错配两者。

76、术语“载体”是本领域众所周知的，并且如本文所用，是指核酸分子，例如双链dna，其可能已经插入有根据本发明的核酸序列。合适地，载体用于将插入的核酸分子转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含所有必需的元件，所述元件使得插入的核酸分子转录，并且优选将转录物翻译成多肽。载体通常包含所有必需的元件，使得一旦载体在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体dna复制或与宿主染色体dna一致地复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的几个拷贝。

77、本文使用的术语“可操作地连接”、“可操作地相连”或等同表述是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得这些元件功能性地连接并且能够以预期的方式彼此相互作用。

78、术语“疗法”“治疗的”或“治疗”是指预防、减少、改善或消除疾病或病况的一种或多种体征、症状或影响。因此，如本文所用的“治疗”或“疗法”包括对哺乳动物，特别是人类中的疾病的任何治疗，包括：(a)预防易患该疾病或有患该疾病的风险但尚未被诊断为患有该疾病的受试者发生该疾病；(b)抑制该疾病，即阻止其发展；和(c)缓解该疾病，即引起该疾病的消退。

79、将药剂向受试者“施用”包括将药剂引入或递送给受试者以实现其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径施用，包括口服、鼻内、眼内、经眼、胃肠外（血管内、肌内、腹膜内或皮下）或局部。施用包括自我施用和他人施用。

80、术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，是指患有需要治疗的疾病或病况的任何个体受试者，合适地患有需要通过本发明的治疗进行治疗的疾病或病况。出于本公开的目的，受试者可以是人或动物，例如灵长类动物，优选人，或另一种哺乳动物，如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。