使用多个转座酶衔接子的单细胞测序的制作方法

背景技术：

1、下一代测序（ngs）允许对dna（包括例如cdna）的快速和有效的核苷酸测序。然而，对于许多测序平台，包括边合成边测序之类的测序方法，可以被测序的dna片段的长度存在限制。如果要确定长序列，则必须将较短序列编译成重叠群。

2、然而，由于异构体（isoform）分析的性质，单细胞异构体rna-seq不能通过ngs（其是短读段测序）技术实现，该分析需要转录物的长程信息以区分各种转录物变体。几乎所有人多外显子基因都是可变剪接的，从而允许单个基因生成多种rna异构体，其产生不同的蛋白质异构体，由此驱动真核生物中的表型复杂性。检测这些异构体有助于揭示基因调控背后的复杂机制，从而深入了解细胞如何微调基因表达以响应不同的生理条件。

3、此外，还已知特定转录物异构体的异常剪接或表达与许多疾病相关联，包括癌症、神经变性病症和遗传综合征。此外，转录物异构体可以通过调节基因功能在群体内产生表型变异。

4、因此，鉴定和表征这些异构体有助于理解疾病机制和表型多样性的遗传基础。然而，使用下一代测序（ngs）来确定异构体存在若干挑战。

5、短读段ngs平台通常生成短测序读段，这可能不足以准确解析复杂的转录物结构，包括具有旁系同源序列的基因、长内含子和跨越多个外显子的广泛可变剪接事件。将短测序读段映射到基因组内的多个位置的模糊性导致在转录物组装期间不准确的异构体鉴定，这使得难以确信地区分全长转录物的密切相关的异构体。

6、加标签片段化（tagmentation）通常用于测序中以生成足够短可用于ngs中的短读段的靶dna片段。ngs的一些工作流程使用负载有第一或第二寡核苷酸衔接子的加标签片段化酶（tagmentase），并允许随后使用第一和第二引物进行扩增。然而，这些方法固有的是，生成的大量片段在两个末端均具有第一寡核苷酸衔接子或在两个末端均具有第二寡核苷酸衔接子，因此在加标签片段化产物的不同末端需要不同衔接子的方法中被丢弃。

技术实现思路

1、在一些实施方案中，提供了生成双链双条形码化的cdna片段的方法。

2、在一些实施方案中，该方法包括：

3、提供经固定和透化的细胞；

4、将逆转录酶和核苷酸以及引物扩散到经固定和透化的细胞中，并在细胞中进行rna的逆转录以形成rna/第一链cdna杂交体；

5、将一组至少三种（例如，3-20种，至少3、4、5、6、7、8、9、10种等）转座酶扩散到经固定和透化的细胞中，该至少三种转座酶中的每一种携带不同的衔接子寡核苷酸，这些转座酶在rna/第一链cdna杂交体中引入断裂以形成rna/第一链cdna杂交片段并在断裂处插入同型衔接子寡核苷酸，其中衔接子寡核苷酸包含：第一衔接子链，其以5'至3'包含：

6、rn序列，其中对于该至少三种转座酶中的每一种的衔接子寡核苷酸，rn序列不同，

7、可选的一个或多个条形码序列，和

8、镶嵌末端（me）序列，

9、以及第二衔接子链，其包含反义me序列，其中转座酶中的一种将衔接子寡核苷酸的第一衔接子链的3'末端共价连接至rna/第一链cdna杂交片段的每条链的5'末端，以形成具有5'突出端的rna/第一链cdna杂交片段。

10、在一些实施方案中，该方法还包括置换第二衔接子链，并且(i)使用rna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用聚合酶延伸第一链cdna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段，或(ii)使用第一链cdna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用从rna起始的聚合酶延伸rna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的rna片段，然后进行第二次逆转录，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段；

11、在一些实施方案中，该方法还包括形成分区，该分区包含(i)包含第一链cdna片段的单个经透化的细胞，和(ii)与具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸连接的珠粒，条形码化寡核苷酸包含第一5' pcr手柄序列、3'捕获序列和条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中该多个克隆条形码化寡核苷酸具有不同的3'捕获序列，使得该多个克隆条形码化寡核苷酸包括转座酶上的所有不同rn序列；

12、可选地，在分区中释放克隆条形码化寡核苷酸；

13、在分区中，将第一克隆条形码化寡核苷酸3'捕获序列连接到第一链cdna片段的第二rn序列（或其互补序列）以形成衔接子连接的中间第二链cdna，其以5'-3'包含：第一5'pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第二rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第二链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列、第一rn序列的反义序列。

14、在一些实施方案中，该方法还包括：在分区中，将第二克隆条形码化寡核苷酸3'捕获序列退火至衔接子连接的中间第二链cdna上的第一rn序列的反义序列，并使用衔接子连接的中间第二链cdna作为模板，用dna依赖性dna聚合酶延伸第二克隆条形码化寡核苷酸，以形成双条形码化的第一链cdna片段，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第一rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第一链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列和第二rn序列的反义序列；

15、在一些实施方案中，该方法还包括使用双条形码化的第一链cdna作为模板延伸衔接子连接的中间第二链cdna，以形成双链双条形码化的cdna片段。

16、在一些实施方案中，该方法包括：

17、提供经固定和透化的细胞；

18、将逆转录酶和核苷酸以及引物扩散到经固定和透化的细胞中，并在细胞中进行rna的逆转录以形成rna/第一链cdna杂交体；

19、将一组至少三种（例如，3-20种，至少3、4、5、6、7、8、9、10种等）转座酶扩散到经固定和透化的细胞中，该至少三种转座酶中的每一种携带不同的衔接子寡核苷酸，这些转座酶在rna/第一链cdna杂交体中引入断裂以形成rna/第一链cdna杂交片段并在断裂处插入同型衔接子寡核苷酸，其中衔接子寡核苷酸包含：第一衔接子链，其以5'至3'包含：

20、rn序列，其中对于该至少三种转座酶中的每一种的衔接子寡核苷酸，rn序列不同，

21、可选的一个或多个条形码序列，和

22、镶嵌末端（me）序列，

23、以及第二衔接子链，其包含反义me序列，其中转座酶中的一种将衔接子寡核苷酸的第一衔接子链的3'末端共价连接至rna/第一链cdna杂交片段的每条链的5'末端，以形成具有5'突出端的rna/第一链cdna杂交片段；

24、置换第二衔接子链，并且(i)使用rna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用聚合酶延伸第一链cdna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段，或(ii)使用第一链cdna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用从rna起始的聚合酶延伸rna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的rna片段，然后进行第二次逆转录，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段；

25、形成分区，该分区包含(i)包含第一链cdna片段的单个经透化的细胞，和(ii)与具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸连接的珠粒，条形码化寡核苷酸包含第一5'pcr手柄序列、3'捕获序列和条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中该多个克隆条形码化寡核苷酸具有不同的3'捕获序列，使得该多个克隆条形码化寡核苷酸包括转座酶上的所有不同rn序列；

26、可选地，在分区中释放克隆条形码化寡核苷酸；

27、在分区中，将第一克隆条形码化寡核苷酸3'捕获序列退火至第一链cdna片段的反义第二rn序列，并使用第一链cdna片段作为模板，用rna/dna依赖性dna聚合酶延伸第一克隆条形码化寡核苷酸，以形成衔接子连接的中间第二链cdna，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第二rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第二链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列、第一rn序列的反义序列；以及

28、在分区中，将第二克隆条形码化寡核苷酸3'捕获序列退火至衔接子连接的中间第二链cdna上的第一rn序列的反义序列，并使用衔接子连接的中间第二链cdna作为模板，用dna依赖性dna聚合酶延伸第二克隆条形码化寡核苷酸，以形成双条形码化的第一链cdna片段，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第一rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第一链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列和第二rn序列的反义序列；

29、以及使用双条形码化的第一链cdna作为模板延伸衔接子连接的中间第二链cdna，以形成双链双条形码化的cdna片段。

30、在一些实施方案中，该方法包括：

31、提供经固定和透化的细胞；

32、将逆转录酶和核苷酸以及引物扩散到经固定和透化的细胞中，并在细胞中进行rna的逆转录以形成rna/第一链cdna杂交体；

33、将一组至少三种（例如，3-20种，至少3、4、5、6、7、8、9、10种等）转座酶扩散到经固定和透化的细胞中，该至少三种转座酶中的每一种携带不同的衔接子寡核苷酸，这些转座酶在rna/第一链cdna杂交体中引入断裂以形成rna/第一链cdna杂交片段并在断裂处插入同型衔接子寡核苷酸，其中衔接子寡核苷酸包含：第一衔接子链，其以5'至3'包含：

34、rn序列，其中对于该至少三种转座酶中的每一种的衔接子寡核苷酸，rn序列不同，

35、可选的一个或多个条形码序列，和

36、镶嵌末端（me）序列，

37、以及第二衔接子链，其包含反义me序列，其中转座酶中的一种将衔接子寡核苷酸的第一衔接子链的3'末端共价连接至rna/第一链cdna杂交片段的每条链的5'末端，以形成具有5'突出端的rna/第一链cdna杂交片段；

38、置换第二衔接子链，并且(i)使用rna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用聚合酶延伸第一链cdna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段，或(ii)使用第一链cdna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用从rna起始的聚合酶延伸rna的3'末端，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的rna片段，然后进行第二次逆转录，以形成与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段；

39、形成分区，该分区包含(i)包含第一链cdna片段的单个经透化的细胞，和(ii)与具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸连接的珠粒，该条形码化寡核苷酸包含第一5'pcr手柄序列、3'捕获序列和该条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中分区还包含具有5'末端序列和3'末端序列的多个不同的桥接寡核苷酸，其中该多个不同的桥接寡核苷酸包括与转座酶上的所有不同rn序列退火或包含转座酶上的所有不同rn序列的末端序列；

40、可选地，在分区中释放克隆条形码化寡核苷酸；以及

41、在分区中，使用桥接寡核苷酸经由退火和聚合酶延伸将条形码化寡核苷酸连接到与5'第一rn序列（r1）和3'反义第二rn序列（r2）连接的第一链cdna片段的两个末端，以形成双链双条形码化的cdna片段，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第一rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第一链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列和第二rn序列的反义序列。

42、在一些实施方案中，该方法还包括由双链双条形码化的cdna片段生成条形码化的cdna片段，该生成包括：

43、在分区中，可选地，用退火至第一5' pcr手柄序列的引物扩增双链双条形码化的cdna片段；

44、合并分区的内容物以形成本体溶液；

45、在本体溶液中，将以5'-3'包含第二pcr手柄序列和me序列的引物退火至双链双条形码化的cdna的链上的me序列的反义序列，并使用双链cdna片段的链作为模板，用dna聚合酶延伸引物以形成以5'-3'包含第二pcr手柄序列和me序列、第一链cdna或第二链cdna片段、me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列、第一或第二rn序列的反义序列和珠粒所特有的条形码序列的反义序列的链；

46、用核酸外切酶处理本体溶液以消化单链3'突出端，从而形成包含第一和第二pcr手柄序列的单条形码化的cdna片段。

47、在一些实施方案中，该方法还包括用在一个或两个末端添加测序衔接子序列的引物扩增条形码化的cdna片段。在一些实施方案中，该方法还包括对cdna片段和连接的条形码序列进行测序以形成测序读段。在一些实施方案中，该方法还包括将测序读段与参考基因组序列比对，并基于序列读段在参考基因组上的位置、共同rn末端序列、共同重叠末端序列、共同条形码序列和/或在参考基因组上映射间隔小于10个核苷酸的cdna末端序列，从测序读段编译较大的cdna序列。

48、在一些实施方案中，聚合酶是bst3.0、bst2.0、superscript ii或superscriptiii。

49、在一些实施方案中，置换和延伸用聚合酶的共混物进行，其中该共混物具有rna依赖性和dna依赖性dna聚合酶活性。

50、在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸包含一个或多个条形码。在一些实施方案中，该一个或多个条形码包括独特分子标识符（umi）条形码。在一些实施方案中，该一个或多个条形码包括样品条形码。

51、在一些实施方案中，分区是液滴、不可渗透胶囊或半渗透胶囊或微孔。

52、还提供了如本文所描述的多个分区。在一些实施方案中，分区包含：

53、(i) 具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸，条形码化寡核苷酸连接到分区中的珠粒或从该珠粒上切割下来，条形码化寡核苷酸包含第一5' pcr手柄序列、3'捕获序列和条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中该多个克隆条形码化寡核苷酸具有不同的3'捕获序列，使得该多个克隆条形码化寡核苷酸包括不同的rn序列；或者

54、具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸，条形码化寡核苷酸连接到分区中的珠粒或从该珠粒上切割下来，条形码化寡核苷酸包含第一5' pcr手柄序列、3'捕获序列和条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中分区还包含具有5'末端序列和3'末端序列的多个不同的桥接寡核苷酸，其中3'末端序列与条形码化寡核苷酸的3'捕获序列退火，并且5'末端序列与不同的rn序列退火；以及

55、(ii) 双条形码化的cdna片段，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第一rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、me序列、第一链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列和第二rn序列的反义序列。

56、还提供了对cdna进行测序的方法。在一些实施方案中，该方法包括：

57、提供经固定和透化的细胞；

58、在细胞中进行逆转录以形成rna/第一链cdna杂交体；

59、将一组至少三种不同的转座酶扩散到经固定和透化的细胞中，该至少三种转座酶中的每一种携带衔接子寡核苷酸，该衔接子寡核苷酸包含镶嵌末端（me）序列和不同的rn序列以形成具有5'突出端的rna/第一链cdna杂交片段；

60、使用rna和与其连接的第一衔接子链作为模板，用聚合酶延伸第一链cdna的3'末端，以形成与5'第一rn序列和3'反义第二rn序列连接的第一链cdna片段；

61、形成分区，该分区包含(i)包含第一链cdna片段的单个经透化的细胞，和(ii)与具有游离3'末端的多个克隆条形码化寡核苷酸连接的珠粒，条形码化寡核苷酸包含第一5'pcr手柄序列、3'捕获序列和条形码化寡核苷酸所连接的珠粒所特有的条形码序列，其中该多个克隆条形码化寡核苷酸具有不同的3'捕获序列，使得该多个克隆条形码化寡核苷酸包括转座酶上的所有不同rn序列；

62、可选地，在分区中释放克隆条形码化寡核苷酸；

63、在分区中形成双链双条形码化的cdna片段，其以5'-3'包含：第一5' pcr手柄序列、珠粒所特有的条形码序列、第一rn序列、me序列、cdna片段序列以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列和第二rn序列的反义序列，其中该形成包括将克隆条形码化寡核苷酸3'捕获序列退火至第一rn序列的反义序列并用聚合酶延伸；

64、合并分区的内容物以形成本体溶液；

65、在本体溶液中，将以5'-3'包含第二pcr手柄序列和me序列的引物退火至双链双条形码化的cdna的链上的me序列的反义序列，并使用双链cdna片段的链作为模板，用dna聚合酶延伸引物以形成以5'-3'包含第二pcr手柄序列和me序列、第一链cdna或第二链cdna片段、me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、第一或第二rn序列的反义序列和珠粒所特有的条形码序列的反义序列的链；

66、用核酸外切酶处理本体溶液以消化单链3'突出端；

67、可选地，用在一个或两个末端添加测序衔接子序列的引物扩增条形码化的cdna片段；以及

68、对cdna片段和连接的条形码序列进行测序以形成测序读段。

69、在一些实施方案中，聚合酶是bst3.0、bst2.0、superscript ii或superscriptiii。

70、在一些实施方案中，置换和延伸用聚合酶的共混物进行，其中该共混物具有rna依赖性和dna依赖性dna聚合酶活性。

71、在一些实施方案中，用dna依赖性dna聚合酶延伸在比置换和退火更高的温度下发生。

72、在一些实施方案中，衔接子寡核苷酸包含一个或多个条形码。在一些实施方案中，该一个或多个条形码包括独特分子标识符（umi）条形码。在一些实施方案中，该一个或多个条形码包括样品条形码。

73、在一些实施方案中，分区是液滴、不可渗透胶囊或半渗透胶囊或微孔。

74、还提供了生成用于测序的cdna片段的方法。在一些实施方案中，该方法包括：

75、提供经固定和透化的细胞；

76、在细胞中进行逆转录以形成rna/第一链cdna杂交体；

77、将一组至少三种不同的转座酶扩散到经固定和透化的细胞中，该至少三种（例如，3-20种，至少3、4、5、6、7、8、9、10种等）转座酶中的每一种携带衔接子寡核苷酸，该衔接子寡核苷酸包含镶嵌末端（me）序列和不同的rn序列以形成具有包含rn序列的5'突出端的rna/第一链cdna杂交片段。

78、还提供了多个如本文所描述的双链双条形码化的cdna片段。在一些实施方案中，片段包含：第一5' pcr手柄序列、条形码序列（例如，珠粒所特有的）、第一rn序列、可选的一个或多个可选条形码序列、镶嵌末端（me）序列、第一链cdna片段以及me序列的反义序列、第一5' pcr手柄序列的反义序列、可选的一个或多个可选条形码序列的反义序列和第二rn序列的反义序列。

79、在一些实施方案中，该多个双链双条形码化的cdna片段中存在至少4、5、6、7、8、9或10个不同的双链双条形码化的cdna片段，其中该至少4、5、6、7、8、9或10个双链双条形码化的cdna片段中的每一个与该至少4、5、6、7、8、9或10个双链双条形码化的cdna片段中的其余片段具有至少一个不同的rn序列。在一些实施方案中，该一个或多个可选条形码是独特分子标识符（umi）条形码、样品条形码或两者。