一种抗菌肽L-023及其抗菌作用

本发明属于生物，具体涉及一种抗菌肽l-023及其抗菌作用。

背景技术：

1、病原微生物耐药性的持续增长已成为当代医学和公共卫生事业面临的重大挑战之一，全球每年因耐药性感染导致的死亡人数呈上升趋势，引发了国际社会的高度重视。在常规抗生素研发速度明显滞后于耐药菌进化速度的大背景下，来源于生物体自身免疫防御系统的抗菌肽（amps）引起了学术界的广泛关注。

2、amps是一类由少量氨基酸残基构成的天然活性多肽，在动物、植物乃至微生物中均有发现，二级结构类型丰富多样，在生物体的抗感染防御中发挥着不可忽视的作用。与常规抗生素相比，抗菌肽表现出不易引发病原菌产生耐药性的独特优势，同时兼具抗菌谱广、对宿主细胞毒性较低等特点，在医疗健康、食品保鲜、饲料添加等应用场景中均展现出较大的开发潜力。当前，围绕抗菌肽的研究正致力于克服其在实际应用中面临的多项瓶颈，如体内代谢稳定性不理想、大规模生产工艺尚不成熟以及生产成本偏高等，以期推动抗菌肽从基础研究向产业化应用的有效转化。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要问题是如何获得一种广谱抗菌活性、低毒性的抗菌肽。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种多肽。

3、本发明提供的多肽为氨基酸序列是mlmtilkavvktigaknvvkiatskpvrdlgkkivereikkrlk的多肽。

4、上述多肽可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

5、具体来说，前文所述抗菌肽的制备方法包括化学合成方式或生物合成方式，所述化学合成方式可为固相合成法；所述生物合成方法可包含以下几种：1）生物合成方法：通过微生物表达系统合成抗菌肽；2）dna合成法：如使用dna合成仪合成抗菌肽基因，并通过融合表达的方式在大肠杆菌中生产抗菌肽；3）氨基酸残基替换和化学修饰：通过设计和改造天然抗菌肽，提高其抑菌效果和降低溶血作用。

6、本发明所述的多肽可采用生物合成方法得到，相关所述生物材料可为如下：

7、c1）编码前文所述多肽的核酸分子；

8、c2）含有c1）所述核酸分子的表达盒；

9、c3）含有c1）所述核酸分子的重组载体、或含有c2）所述表达盒的重组载体。

10、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

11、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码所述多肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述多肽的核苷酸序列75%或75%以上同一性的核苷酸，只要编码所述多肽且具有所述多肽功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

12、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列或核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

13、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、ti质粒或病毒载体。

14、在一个具体的实施例中，本发明中，所述多肽采用固相合成法合成得到，经过纯化获得纯度大于95%的多肽。

15、上述多肽的药用盐也属于本发明要求保护的范围。

16、本发明还提供了抑制细菌或治疗细菌感染性疾病的药物，所述药物含有前文所述的多肽或所述的药用盐。

17、本发明的多肽的药用盐，包括醋酸盐（acetate）、乳糖醛酸盐（lactobionate）、苯磺酸盐（benzenesulfonate）、月桂酸酯（laurate）、安息香酸盐（benzoate）、苹果酸盐（malate）、重碳酸盐（bicarbonate）、马来酸盐（maleate）、硫酸氢盐（bisulfate）、扁桃酸盐（mandelate）、酒石酸氢盐（bitartrate），甲磺酸盐（mesylate），硼酸盐（borate），溴甲烷（methylbromide），溴化物（bromide），硝酸甲酯（methylnitrate），依地酸钙（calciumedetate），甲基硫酸盐（methylsulfate）,右旋樟脑磺酸（camsylate），粘酸盐（mucate），碳酸盐（carbonate），萘磺酸盐（napsylate），氯化物（chloride），硝酸盐（nitrate），棒酸盐（clavulanate），n-甲葡糖胺（n-methylglucamine），柠檬酸盐（citrate），铵盐（ammoniumsalt），二氢氯化物（dihydrochloride），油酸盐（oleate），乙二胺四乙酸盐（edetate），草酸盐（oxalate），乙二磺酸盐（edisylate），扑酸盐（pamoate），双羟萘酸盐（embonate），丙酸酯月桂硫酸酯（estolate），棕榈酸盐（palmitate），乙磺酸酯（esylate），泛酸盐（pantothenate），延胡索酸盐（fumarate），磷酸盐/二磷酸（phosphate/diphosphate）,葡庚糖酸盐（gluceptate），聚半乳糖醛酸盐（polygalacturonate），葡萄糖酸盐（gluconate），水杨酸盐（salicylate），谷氨酸盐（glutamate），硬脂酸盐（stearate），对羟乙酰氨基苯胂酸（glycollylarsanilate），硫酸盐（sulfate），羟基苯甲酸盐（hexylresorcinate），碱式乙酸盐（subacetate），海巴（hydrabamine），琥珀酸盐（succinate），氢溴酸盐（hydrobromide），丹宁酸盐（tannate），氢氯化物（hydrochloride），酒石酸盐（tartrate），羟萘酸盐（hydroxynaphthoate），8-氯茶碱盐（teoclate），碘化物（iodide），甲苯磺酸盐（tosylate），三乙基碘（triethiodide），乳酸（lactate）,戊酸盐（valerate）等。

18、药用盐可以由阳离子如钠（sodium）、钾（potassium）、铝（aluminum）、钙（calcium）、锂（lithium）、锰（magnesium）和锌（zinc）、铋（bismuth）等所形成，也可由碱如氨、乙二胺（ethylenediamine）、n-甲基-谷氨酰胺（n-methyl-glutamine）、赖氨酸（lysine）、精氨酸（arginine）、鸟氨酸（ornithine）、胆碱（choline）、n,n'-二苄基乙二胺（n,n'-dibenzylethylene-diamine）,氯普鲁卡因（chloroprocaine），二乙醇氨（diethanolamine），普鲁卡因（procaine）,二乙胺（diethylamine），哌嗪（piperazine），三羟甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane）和羟化四甲铵（tetramethylammonium hydroxide）等所形成。

19、上述这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物（hydrochloride）、氢溴化物（hydrobromide）、醋酸盐（acetate）、扑酸盐（pamoate）等等可用作剂型；在一个酸性基团（如-cooh）或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯（acetate）、马来酸酯（maleate）、三甲基乙酸氯甲酯（pivaloyloxymethyl）等，以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。

20、上文中，所述药物除含有seq id no:1的多肽或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料（如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等）、难溶性载体材料（如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等）、肠溶性载体材料（如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等）。其中优选的是水溶性载体材料。

21、使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。

22、所述多肽为抗菌肽l-023，所述抗菌肽l-023分子量为4.95 kda，等电点为11.178，平均疏水性为0.007。

23、所述抗菌肽l-023的纯度及分子量经高效液相色谱（hplc）与质谱（ms）联合鉴定。hplc检测采用chromcore 120 c18 5u色谱柱（4.6×250 mm），以0.1%tfa水溶液（流动相a）和0.1%tfa乙腈溶液（流动相b）为流动相进行梯度洗脱，流速1.0 ml/min，检测波长220 nm，进样体积10 μl。

24、本文中，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

25、进一步地，所述革兰氏阳性菌为斯氏芽孢杆菌（

bacillusspizizenii）和金黄色葡萄球菌金黄色亚种（

staphylococcus aureus subsp.

aureus）；所述革兰氏阴性菌为鲍曼不动杆菌（

acinetobacter baumannii）、大肠杆菌（

escherichiacoli）、铜绿假单胞菌（

pseudomonas aeruginosa）和肺炎克雷伯菌肺炎亚种（

klebsiella pneumoniae subsp.

pneumoniae）。

26、更进一步地，所述药物中所述多肽的使用浓度为4至256 μg/ml。

27、在一个具体的实施例中，所述抗菌肽l-023对鲍曼不动杆菌（

acinetobacter

baumannii）atcc 19606的最低抑菌浓度（mic）为4 μg/ml；对大肠杆菌（

escherichia coli）atcc 25922和肺炎克雷伯菌肺炎亚种（

klebsiella pneumoniaesubsp.

pneumoniae）atcc13883的最低抑菌浓度（mic）为8 μg/ml；对铜绿假单胞菌（

pseudomonas aeruginosa）atcc27853 的最低抑菌浓度（mic）为16 μg/ml；对斯氏芽孢杆菌（

bacillus spizizenii）atcc6633的最低抑菌浓度（mic）为64 μg/ml；对金黄色葡萄球菌金黄色亚种（

staphylococcus

aureus subsp.

aureus）atcc 25923的最低抑菌浓度（mic）为256 μg/ml。

28、前文所述的多肽在制备抑制细菌或治疗细菌感染性疾病的药物中的应用也属于本发明要求保护的范围。

29、前文所述的药用盐在制备抑制细菌或治疗细菌感染性疾病的药物中的应用也属于本发明要求保护的范围。

30、本发明还提供了前文所述的药物在如下任一种中的应用：

31、1）制备抑制细菌活性的产品中的应用；

32、2）制备用于抑制细菌活性的产品中的应用；

33、3）制备治疗细菌感染性疾病的产品中的应用；

34、4）制备用于治疗细菌感染性疾病的产品中的应用。

35、所述细菌可为前文所述细菌。