靶向高反应活性赖氨酸的胞内蛋白质原位RAFT聚合方法

本发明属于化学生物学，具体涉及一种靶向高反应活性赖氨酸的胞内蛋白质原位raft聚合方法。

背景技术：

1、蛋白质表面的高反应活性赖氨酸在维持蛋白质结构稳定、介导蛋白-蛋白相互作用以及调控细胞信号传导过程中发挥重要作用。赖氨酸侧链含有伯胺结构，其在生理条件下具有较高的亲核性，能够参与多种生物化学反应，并在蛋白质翻译后修饰、酶催化以及分子识别过程中发挥关键作用。在细胞内环境中，部分赖氨酸残基由于其周围微环境、电荷分布或空间暴露程度的差异，表现出更高的反应活性，这类高反应活性赖氨酸往往在调控蛋白质功能及信号通路中具有重要意义。因此，针对蛋白质表面高反应活性赖氨酸的化学修饰策略逐渐成为化学生物学和药物化学研究的重要方向。

2、近年来，基于高反应活性赖氨酸反应性的共价化学策略逐渐成为蛋白质功能调控和共价药物设计的重要研究方向。研究人员开发了多种能够与赖氨酸ε-氨基发生共价反应的小分子试剂，例如酰化试剂、醛类化合物以及多种亲电试剂，这些试剂能够通过共价键与赖氨酸残基结合，从而改变蛋白质的活性或稳定性。在药物研发领域，一些靶向赖氨酸残基的共价抑制剂已被用于调控酶活性或阻断特定信号通路，为疾病治疗提供了新的策略。

3、然而，现有的赖氨酸靶向策略主要依赖小分子共价抑制剂，通过亲电试剂与赖氨酸ε-氨基形成共价键，从而阻断蛋白质功能。这类策略通常属于“静态关断”模式，即通过共价修饰直接抑制蛋白质的活性或阻断其与其他分子的相互作用。虽然该方法在药物开发中具有重要应用价值，但其作用方式通常局限于抑制或削弱蛋白质既有功能，难以在分子层面赋予蛋白质新的功能或结构特性。此外，小分子共价修饰往往只能引入有限的化学基团，其结构复杂度和功能可调性相对有限，难以实现对蛋白质行为的精细调控。

4、另一方面，近年来发展起来的细胞内原位聚合技术为在活细胞环境中构建人工高分子结构提供了新的研究思路。该策略通过在细胞内部直接引发单体聚合反应，使单体在生物环境中逐步形成聚合物链段，从而在细胞内构建具有特定理化性质的高分子结构。与传统的化学修饰方法相比，原位聚合能够引入结构更为复杂、尺寸更大的聚合物结构，并通过调控单体种类、聚合度以及聚合条件实现多样化功能调控。因此，该技术在化学生物学、药物递送以及细胞工程等领域受到了广泛关注。

5、尽管细胞内原位聚合技术近年来取得了一定进展，但现有方法大多集中在细胞或细胞器尺度，例如在细胞质或细胞膜区域形成聚合物网络或纳米结构。这类方法虽然能够影响细胞整体行为，但其空间分辨率相对较低，难以实现对单个蛋白质分子的精准调控。同时，由于细胞内环境复杂，如何在保持生物相容性的条件下实现聚合反应的可控进行，也是该领域面临的重要挑战。

6、此外，现有原位聚合体系通常依赖自由扩散的引发剂或聚合位点，其反应位置难以精确定位，因此很难将聚合反应直接锚定在特定蛋白质分子上。缺乏有效的分子锚定策略，使得聚合物结构往往随机分布于细胞环境中，难以实现针对特定蛋白质的分子尺度调控。若能够将聚合反应位点精准定位于蛋白质表面，并在蛋白质分子尺度上生长聚合物链段，则有望为蛋白质功能调控提供一种新的研究手段。

7、因此，如何在活细胞环境中实现针对特定蛋白质的分子尺度原位聚合，并利用聚合物链段对蛋白质结构、相互作用及细胞命运进行调控，仍然是当前化学生物学领域亟待解决的重要科学问题，也是蛋白质工程和功能材料研究中的一个重要发展方向。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种靶向高反应活性赖氨酸的胞内蛋白质原位raft聚合方法，以解决现有技术中高反应活性赖氨酸共价调控策略主要停留在蛋白质功能抑制层面、难以实现蛋白质行为动态调控的问题。本发明利用过氧化氢（h2o2）响应型链转移剂在活细胞环境中实现蛋白质表面原位raft聚合，通过在活细胞环境中构建蛋白质表面聚合物结构，实现蛋白质分子尺度的化学重编程，为蛋白质功能调控及细胞命运调控提供新的技术手段。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、靶向高反应活性赖氨酸的胞内蛋白质原位raft聚合方法，包括如下步骤：

4、（1）烯丙胺-bpin中间体的合成：

5、将炔丙胺溶解于无水二氯甲烷中，在冰浴条件下加入三乙胺作为碱性催化剂，随后缓慢滴加二叔丁基碳酸酐，在0℃条件下搅拌反应30~40min，然后升温至室温继续反应3~5h，反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相，并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂后通过硅胶柱层析纯化，得到boc保护的炔丙胺中间体；将boc保护的炔丙胺中间体溶解于四氢呋喃中，在氮气保护条件下加入双频哪醇硼烷试剂，室温下反应，反应结束后加入蒸馏水终止反应，并用乙酸乙酯进行萃取，所得有机相经无水硫酸钠干燥后浓缩，通过硅胶柱层析纯化得到烯丙胺-bpin中间体；

6、（2）h2o2响应型链转移剂pro-cta的合成：

7、将烯丙胺-bpin中间体溶解于n’n-二甲基甲酰胺（dmf）中，同时加入n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）活化的raft链转移剂，在室温条件下搅拌反应，反应完成后将反应液倒入去离子水中析出产物，得到h2o2响应型链转移剂pro-cta；

8、（3）将h2o2响应型链转移剂pro-cta加入预先无血清培养的肿瘤细胞体系中，培养4~6h后更换有血清培养基并加入单体和光引发剂irgacure 2959孵育4~6 h后，随后在紫外光照射条件下进行聚合反应，形成蛋白质-聚合物偶联物。

9、进一步地，步骤（2）中，搅拌反应时间为12~16h。

10、进一步地，步骤（3）中，肿瘤细胞体系包括但不限于4t1、b16f10、hela等肿瘤细胞系。

11、进一步地，步骤（3）中，h2o2响应型链转移剂pro-cta的添加浓度为20~50 μm。

12、进一步地，步骤（3）中，紫外光波长为365nm。

13、进一步地，步骤（3）中，单体选自n-异丙基丙烯酰胺（nippam）、聚乙二醇甲基丙烯酸酯（peg-ma）、甲基丙烯酸羟丙酯（hpma）、生物素-聚乙二醇-丙烯酸酯（biotin-peg-aca）或其他可参与raft聚合的丙烯酸类或甲基丙烯酸类单体。

14、本发明还提供上述胞内蛋白质原位raft聚合方法制得的蛋白质-聚合物偶联物。

15、进一步地，本发明提供上述蛋白质-聚合物偶联物在制备细胞调控剂或抗肿瘤药物中的应用。

16、本发明首先合成具有h2o2响应性的保护型链转移剂 pro-cta，pro-cta包含硼酸酯保护的醛基结构，其在过氧化氢环境下脱保护生成活性醛基。因此在肿瘤细胞的氧化环境中，pro-cta能够脱保护生成醛基，并与蛋白质表面的赖氨酸ε-氨基发生共价反应形成席夫碱结构，从而形成蛋白质-cta复合物，该蛋白质-cta复合物能够作为链转移剂，通过光控可逆加成-断裂链转移（photo-raft）聚合引发功能单体在蛋白质表面发生原位聚合。

17、与现有技术相比，本发明具有如下优点：

18、（1）本发明通过高反应活性赖氨酸作为化学锚点，实现蛋白质分子尺度的精准原位聚合调控；

19、（2）本发明利用过氧化氢响应型链转移剂，使聚合反应能够在肿瘤细胞特定微环境中选择性触发，从而提高反应的生物选择性；

20、（3）本发明通过光控raft聚合反应，使聚合过程具有良好的时空可控性；

21、（4）本发明通过调节聚合单体的理化性质，可以显著改变蛋白质的空间分布与动态行为，例如降低蛋白质扩散能力或诱导蛋白质聚集，实现蛋白质行为的可编程调控，从而干扰细胞内蛋白质网络并影响细胞功能及细胞命运，在制备细胞调控剂或抗肿瘤药物等领域中具有潜在的应用前景。