抗CCR8抗体的药物制剂的制作方法

本发明涉及用于稳定治疗性抗ccr8抗体的安全的药物制剂。所述药物制剂以液体（例如冷冻液体）或冻干形式提供，并且可以是即用型形式，或者可以进一步稀释用于静脉输注或皮下注射。技术问题根据本发明，必须针对一组最近开发的去岩藻糖基化抗人ccr8抗体确定一种安全且稳定的药物制剂。ccr8主要由活化的肿瘤内调节性t细胞（treg）表达，这些细胞负责肿瘤的免疫逃逸。尽管ccr8作为趋化因子受体，但它并非活化的treg细胞趋化或免疫抑制所必需。因此，清除ccr8阳性的肿瘤浸润treg细胞，而非阻断ccr8的功能，似乎是有效的抗肿瘤免疫治疗的关键。其潜在作用机制由george plitas和alexander rudensky领导的团队首次公开（plitas, g., et al. “abstract p4-04-11: preferential expression ofthechemokine receptor 8 (ccr8) on regulatory tcells (treg) infiltrating humanbreastcancers represents a novel immunotherapeutic target.” (2016): p4-04.；plitas, george, et al. “regulatory tcells exhibit distinct features in humanbreastcancer.” immunity 45.5 (2016): 1122-1134.；us10087259）。此后，研究人员一直试图寻找临床上优越的抗人ccr8抗体，以特异性清除肿瘤内treg。然而，到目前为止，仅公开了少数用于储存这些抗ccr8抗体并将所得抗人ccr8抗体配制成临床药物使用的制剂。根据本发明的药物制剂被发现在食蟹猴中是安全的，并且不会显著诱导或增加细胞因子的释放。此外，它们在方便的储存条件下稳定抗人ccr8抗体，例如通过防止/减少聚集和降解，特别是通过防止碱性抗体种类的过度形成。本文公开的药物制剂最初是为了稳定去岩藻糖基化的抗人ccr8抗体tpp-23411而开发的，但也可用于具有至少部分相似性质的其他抗ccr8抗体，如本文其他地方所列举的那些。tpp-23411是一种igg1型的去岩藻糖基化单克隆抗人ccr8抗体，首次公开于wo2021152186中。wo2021152186中公开的抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（adcc）和抗体依赖性细胞吞噬作用（adcp）有效清除表达ccr8的靶细胞。更详细地说，tpp-23411通过接合人nk92v细胞或人原代m2c巨噬细胞作为效应细胞，触发对人多发性骨髓瘤原代ccr8+ treg或异位表达人ccr8的hek293靶细胞的有效且剂量依赖性的清除。去岩藻糖基化显著增强tpp-23411的adcc效力，同时保持其adcp效力。根据本发明，提供了一种用于抗ccr8抗体的药物制剂，以实现其在临床中的稳定和安全药用。单克隆抗体（mab）由于其多种翻译后修饰和降解事件，其生化和生物物理性质具有异质性。当通过基于电荷的分离技术（包括等电聚焦（ief）、毛细管等电聚焦（cief）、阳离子交换色谱（cex）和阴离子交换色谱（aex））分析mab时，可以观察到不同的变体。与主要种类相比，不同的变体通常被称为酸性或碱性种类。当使用基于ief的方法分析时，酸性种类是表观pi较低的变体，而碱性种类是相对于主要变体具有较高表观pi的变体。当通过基于色谱的方法分析时，酸性种类和碱性种类根据它们相对于主峰的保留时间来定义。酸性种类是从cex中早于主峰洗脱或从aex中晚于主峰洗脱的变体，而碱性种类是从cex中晚于主峰洗脱或从aex中早于主峰洗脱的变体，参见du, yi et al.“

chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant

monoclonal antibodies.” mabs vol. 4,5 (2012): 578-85. doi:10.4161/mabs.21328。

电荷变体可能显著影响抗体的体外和体内性质。已经证实了使用化学修饰的抗体，电荷变化可以改变与蛋白质或细胞膜靶标的结合，从而影响抗体的组织穿透、组织分布和药代动力学（pk）。因此，取决于各自的抗体，稳定“正确的”变体是非常重要的。已经描述了多种可能导致特定抗体化学降解并可能将主要变体变为不同种类的百分比的机制。这些机制包括，例如：a. 琥珀酰亚胺形成，b. 甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸或色氨酸的氧化导致构象变化，c. 二硫键介导的降解导致构象变化，d. 去唾液酸化（末端半乳糖）导致cooh丢失，e. c末端赖氨酸和甘氨酰酰胺化导致nh2形成或cooh丢失，f. asp异构化导致构象变化，g. 剪切/断裂导致nh2丢失/构象变化。

背景技术：

1、在美国申请号17/142,862中，建议用于抗人ccr8抗体的药物制剂包含：pbs；20 mmnaoac，ph 5.2，50 mm nacl；和/或10 mm naoac，ph5.2，9%蔗糖。

2、在wo2025/011439 a1中，建议用于抗人ccr8的药物制剂包含乙酸钠作为缓冲剂，制剂的ph值为4.5至6.0。

3、wo2024/240224 a1公开了不包含甲硫氨酸且非专门适用于去岩藻糖基化抗人ccr8抗体的制剂。

4、可使用本发明所述药物制剂配制的抗ccr8抗体公开于例如wo2020/138489、wo2021/142002、wo2021/163064、wo2021/178749、wo2021/194942、wo2021152186、wo2022/003156和wo2022/042690。进一步的抗ccr8抗体公开于wo2021/178749 a1、wo2020/138489a1、wo2023/219147 a1、wo2021/194942 a1、wo2023/230473 a1、wo2021/142002 a1、wo2021/163064 a1、wo2022/042690 a1、wo2022/256563 a1、wo2022/081718 a1、wo2023/288241 a1、wo2023/010054 a1、wo2022/078277 a1、wo2023/137466 a1、wo2023/098888a1、wo2023/174396 a1、wo2023/206938 a1、wo2023/201812 a1、wo2023/206350 a1、wo2023/193732 a1、wo2021/178749 a1、wo2022/216965 a1、wo2022/241034 a1、wo2022/136647 a1和wo2022/136650 a1。

5、问题的解决方案

6、根据本发明，提供了一种包含抗人ccr8抗体的药物制剂，其中所述药物制剂包含：

7、a. 2.5-15 mm组氨酸；

8、b. 50-200 ppm聚山梨醇酯，优选50-100 ppm聚山梨醇酯，优选聚山梨醇酯80；

9、c. 5%-8%蔗糖；

10、d. 10-50 mm精氨酸；

11、e. 2.5-50 mm甲硫氨酸；以及

12、f. 25 mg/ml-150 mg/ml的所述抗人ccr8 igg抗体，

13、并且其中所述药物制剂的特征在于ph值为6.3 ± 0.5。

14、药物制剂的ph为约6.3时实现最佳效果。

15、所述药物制剂以液体（例如冷冻液体）或冻干形式提供，并且可以是即用型形式，或者可以进一步稀释用于施用，例如静脉输注或皮下注射。所述药物制剂特别适用于去岩藻糖基化的抗人ccr8抗体，例如人igg1型的抗人ccr8抗体。

16、根据本发明提供的有利制剂的优势为：

17、• 是液体或冻干制剂，

18、• 适用于高浓度抗ccr8抗体，从而可以达到可接受的总体积，以满足适当的医疗剂量和给药方案的要求，

19、• 可能通过ph调节来稳定抗ccr8抗体，

20、• 避免在储存期间出现抗ccr8抗体的碱性种类的不可接受增加，

21、• 支持便捷的储存条件，例如在-30℃下至少六个月或更长时间，

22、• 是不含盐（氯化钠或硫酸钠）的制剂，

23、• 是基本上等渗的且基本上等张的，并且

24、• 最终被发现在食蟹猴中是安全的，且没有任何不可接受的细胞因子释放效应。

25、因此，提供的药物制剂解决为抗ccr8抗体寻找有利药物制剂的问题。

26、序列id的简要说明

27、本技术附有序列列表。seq id no:1至seq id no:800涉及可使用本文公开的药物制剂配制的抗体。

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51、定义

52、除非另有定义，说明书、附图和权利要求中使用的所有科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的普通含义。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用并入本文。如有冲突，应以本说明书（包括定义）为准。如果通过引用并入的两个或多个文件包含相互冲突和/或不一致的公开，则以生效日期较晚的文件为准。如果参考了数据库，则有效数据应为适用于2022年6月10日的版本号，除非另有说明。材料、方法和实施例仅是说明性的，并非旨在限制。除非另有说明，本文件中使用的以下术语，包括说明书和权利要求书，具有以下定义。

53、此处使用的表达式“约”或“~”是指本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内的值，这将部分取决于如何测量或确定该值，即取决于测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个或1个以上的标准偏差内。术语“约”也用于表示所讨论的量或值可以是指定的值或近似相同的其他值。该短语旨在传达类似的值促进如本文所述的等同结果或效果。在这种情况下，“约”可以指高于和/或低于至多10%的范围。无论何时为某一测定或实施方式指定术语“约”，该定义均适用于特定上下文。

54、除非另有说明，术语“大约”可指高达10%的上下范围。

55、术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等应扩展或开放式地阅读。当在说明书中使用时，术语“包括”包括“由…组成”。

56、单数形式如“一个/一种（a/an）”或“所述/该（the）”包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“单克隆抗体”包括单一单克隆抗体以及多种相同或不同的单克隆抗体。同样，“细胞”包括单一细胞和多种细胞。

57、除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指向该系列中的每个元素。术语“至少一种”和“至少其中一种”包括例如一种、两种、三种、四种、五种或更多种元素。

58、还应理解，高于和低于规定范围的轻微变化可用于实现与该范围内的值基本相同的结果。此外，除非另有指示，否则范围的公开旨在作为包括最小值和最大值之间的每个值的连续范围。

59、如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。一种蛋白质或肽必须至少包含两个氨基酸，并且对氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用的，该术语既指短链（其在本领域中也通常被称为例如肽、寡肽和低聚物），又指长链，长链通常在本领域被称为蛋白质，具有多种类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段、基本同源多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体，多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

60、如果对某一物种（如小鼠）的基因或蛋白质进行了一般性引用，则除非另有说明或明显不兼容，否则同样应指人类的类似物。这尤其适用于生物标志物。

61、当应用于核酸、多肽、蛋白质或抗体时，术语“分离的”表示该核酸、多肽或蛋白质或抗体基本上不含在自然状态下与其相关的其他细胞成分。它优选处于均匀状态。它可以是干溶液或水溶液。纯度和均一性通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来确定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质、多肽或抗体被实质上纯化。特别是，分离的基因与基因侧翼并编码感兴趣基因以外的蛋白质的开放阅读框分离。然而，分离的多肽可以例如通过合适的接头固定在珠或颗粒上。

62、术语“纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。特别地，这意味着核酸或蛋白质是至少85%纯度，更优选地至少95%纯度，最优选地至少99%纯度。

63、如本文所使用的，术语“合成”，例如合成核酸分子或合成基因或合成肽是指通过重组方法和/或化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。如本文所使用的，通过使用重组dna方法的重组手段生产意味着使用众所周知的分子生物学方法来表达由克隆dna编码的蛋白质。

64、“翻译后修饰”（ptm）是指肽或蛋白质的共价修饰，这些修饰是在自然条件下蛋白质生物合成后引入的。该术语包括但不限于糖基化、磷酸化、酰化、腺嘌呤化、法尼酰化、泛素化和硫酸化。翻译后修饰可能影响肽或蛋白质的活性。2004年，gutiérrez等描述了小鼠ccr8趋化因子受体的硫酸化和糖基化状态，以及这些翻译后修饰影响ccr8活性的方式。他们认为，小鼠ccr8第14和15位的酪氨酸是硫酸化的氨基酸残基，而天冬酰胺8和苏氨酸10和12被糖基化的。此外，他们表明，硫酸化对ccr8的活性很重要（gutiérrez, julio, et al."analysis of post-translational ccr8 modifications and their influence onreceptor activity." journal of biological chemistry 279.15 (2004): 14726-14733）。

65、“序列同一性”或“百分比同一性”是一个数字，描述查询序列与目标序列的相似程度，更准确地说，每个序列中有多少字符在比对后是相同的。计算序列同一性的最流行的工具是blast（基本局部比对搜索工具，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，其执行序列对之间的比较，搜索局部相似性区域。合适的比对方法是本领域已知的，例如用于全局比对的needleman-wunsch算法，其使用blosum62矩阵，缺口开放惩罚为11，缺口扩展惩罚为1，可以对比对的相同残基对进行计数，然后除以比对的总长度（包括内部和外部的缺口），得出同一性百分比值。

66、对于“百分比相似性”或“序列相似性”值，可以使用与百分比同一性值相同的方法，除了计算的是具有非负值的 blosum62 值的比对残基对，而不是相同残基对（即≥0)。

67、“七次跨膜受体”（7-tm受体）是包含七次跨膜螺旋的完整膜蛋白。如本文所用，7-tm受体是g蛋白偶联受体。

68、“趋化因子受体”是七次跨膜受体。趋化因子受体家族在人类中包含24个成员，根据它们结合的趋化因子的种类，可以细分为四个亚家族：cx3cr、cxcr、ccr和xcr，它们都激活g蛋白，ackr包含6个非典型受体，在配体结合时不能激活g蛋白。

69、“cxc趋化因子受体”（cxcr）是一种特异性结合并响应cxc趋化因子家族的细胞因子的完整的膜蛋白。它们代表趋化因子受体的一个亚家族，因为跨越细胞膜七次被称为七次跨膜（7-tm）蛋白的g蛋白连接受体的大家族。目前，哺乳动物中已知有七种cxc趋化因子受体，分别命名为cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5和cxcr6。cxcr6在结构上与cc趋化因子受体比与其他cxc趋化因子受体更密切相关。

70、“cc趋化因子受体”（ccr，也称为β趋化因子受体）是一种特异性结合并响应cc趋化因子家族的细胞因子的完整的膜蛋白。它们代表趋化因子受体的一个亚家族，因为跨越细胞膜七次被称为七次跨膜（7-tm）蛋白的g蛋白连接受体的大家族。cc趋化因子受体的亚家族包括ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9和ccr10。

71、术语“ccr8”是指c-c趋化因子受体类型8。ccr8蛋白由基因ccr8（ncbi基因id1237）编码。ccr8的同义词尤其是cc-ckr-8、ccr-8、cdw198、ckrl1、cmkbr8、cmkbrl2、gprcy6、cy6、ter1。ccr8蛋白包括人、鼠、大鼠、恒河猴以及其他哺乳动物和非哺乳动物同源物。人类ccr8的序列可通过uniprot标识符p51685（ccr8_human）访问，例如人类同种型p51685-1或p51685-2（uniprot，2019年11月29日）。鼠ccr8的序列可通过uniprot标识符p56484（ccr8_mouse）访问。恒河猴ccr8的序列可通过uniprot标识符o97665（ccr8_macmu）访问。不同物种可能存在不同的同种型和变体，并且都由术语ccr8组成。也包括成熟前后的ccr8分子，即独立于一个或多个前结构域的切割。此外，可以产生ccr8蛋白的合成变体，并被术语ccr8包含。此外，ccr8蛋白质可以进行各种修饰，例如，合成或天然发生的修饰，例如翻译后修饰。重组人ccr8可商购或可如本领域已知的那样制造。ccr8是趋化因子ccl1/scja1/i-309的受体。barington等报道了细胞外环2（ecl-2）中保守的胞外二硫桥和芳香残基对于趋化因子受体ccr8中配体结合和激活的重要性（barington, line, et al. "roleof conserved disulfide bridges and aromatic residues in extracellular loop 2of chemokine receptor ccr8 for chemokine and small molecule binding." journalof biological chemistry 291.31 (2016): 16208-16220）。此外，他们发现ecl-2中的两个不同的芳香族残基，tyr184（cys+1）和tyr187（cys+4），分别对cc趋化因子ccl1（激动剂）和mc148（拮抗剂）的结合至关重要，但对小分子的结合不重要。

72、“程序性死亡-1（pd-1）”是指属于cd28家族的免疫抑制受体。pd-1主要在体内先前激活的t细胞上表达，并与两种配体pd-l1和pd-l2结合。本文中使用的术语“pd-1”包括但不限于人pd-1（hpd-1）、hpd-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hpd-1序列可在genbank登录号u64863（2019年11月29日）中找到。

73、“程序性死亡配体-1（pd-l1）”是pd-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一（另一种是pd-l2），其在与pd-1结合时下调t细胞激活和细胞因子分泌。本文中使用的术语“pd-l1”包括但不限于人pd-l1（hpdl1）、hpd-l1的变体、同种型和物种同源物，以及与hpd-l1具有至少一个共同表位的类似物。完整的hpd-l1序列可以在genbank登录号q9nzq7（2019年11月29日）中找到。

74、“foxp3”是一种50-55kd的转录因子，也称为forkhead box 蛋白p3、scurfin、jm2或ipex。与大多数细胞表面标志物相比，它被认为是调节性t细胞的主调节基因和更特异的标志物。foxp3在cd4+/cd25-细胞中的转导表达已被证明可诱导gitr、cd103和ctla4，并赋予调节性t细胞表型。biolegend抗体克隆206d和259d识别氨基酸105-235区域中的人foxp3表位。poly6238识别人和小鼠foxp3，并针对foxp3的n端部分。

75、术语“调节”是指现有过程或行为的任何改变，如阻断（拮抗）和诱导（激动）。例如，g蛋白非依赖性信号传导的调节是指g蛋白非依赖性信号传导的任何显著改变。

76、抗体、片段或缀合物的术语“内化”是指将抗体、片段和缀合物摄取到细胞中。优选地，确定具有内源性靶表达（例如本文别处所述的人或小鼠ccr8）的细胞系的内化。优选地，内化通过测量每个细胞的总内化荧光强度来确定，并相对于同种型对照进行量化，例如如实施例10.5所述。简而言之，用染料标记抗体、片段或偶联物和匹配的同种型对照，并且相对于同种型对照测定和定量抗体、片段或偶联物的内化荧光。“非内化抗体”定义为显示出与相应同种型对照基本相同的内化作用的抗体。“低内化抗体”定义为显示内化等于或低于同种型对照内化10 倍，优选地低于同种型对照内化的 9-、8-、7-、6-、5-、4-、3-、2-、1.5-、1.4-、1.3-、1.2-或1.1倍。“中等内化抗体”定义为显示等于或低于同种型对照内化的21倍并且高于同种型对照内化的10倍的内化的抗体。“高内化抗体”定义为高于同种型对照内化的21倍的内化的抗体。

77、在替代方式中，内化还可以基于t（1/2）进行量化，即直到抗体、片段或缀合物的一半量被内化的时间。优选地，根据本发明的抗体的特征在于直到抗体、片段或缀合物的一半量被内化的时间，该时间为＞2小时，优选＞4、＞5、＞6、＞7、＞8、＞9、＞10、＞11、＞12、＞13、＞14、＞15、＞16、＞17、＞18、＞19、＞20、＞21、＞22、＞23、＞24、＞26、＞28、＞30或＞48小时。最优选地，根据本发明的抗体根本不被内化，即在抗体、片段或缀合物的一半量被内化之前不能定义时间。

78、“同种型对照”是一种抗体或片段，其不与靶标结合，但具有与识别靶标的参考抗体或片段相同的类别和类型。

79、如果抗体或片段结合来自两种或多种不同物种的抗原，例如kd值为10-7m或更低，更优选地小于10-8m，甚至更优选地在10-9m至10-11m的范围内，则抗体或片段被称为“交叉反应”或“交叉反应性”。

80、本文中所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原，但实质上不识别或结合样品中的其他分子的抗体：以实质性非特异性结合为特征的抗体将缺乏治疗适用性，因此这些实施方式被排除在外。然而，如本领域已知的，抗体或结合物的特异性结合不一定排除抗体或结合物与其他抗原/靶分子的结合。特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个其他物种的抗原。这种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。

81、在某些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二种化学物质的相互作用，意味着相互作用取决于化学物质上特定结构（例如抗原决定簇或表位）的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般地结合蛋白质。如果抗体对表位“a”具有特异性，则在含有表位“a”和抗体的反应中，含有表位a的分子（或游离的、未标记的a）的存在将减少与抗体结合的标记a的量。

82、在有疑问的情况下，抗体或结合物的特异性结合优选描述抗体、抗体片段或结合物以至少10-7m的亲和力（作为kd值；即优选kd值小于10-7m）与其抗原/靶标的结合，其中所述抗体或结合物对非特异性抗原具有至少两倍更低的亲和力，所述非特异性抗原不是预定的抗原/靶标分子或密切相关的抗原/靶标分子。

83、“多特异性”，也称为“多反应性”或“非特异性结合”，是指结合物或抗体结合一组确定的无关抗原的能力。如果抗体的（治疗）适用性受到损害，非特异性结合是实质性的。非蛋白质结构的多特异性，包括但不限于靶阴性细胞系或组织、杆状病毒颗粒（bvp）、胰岛素或dna，可以如本领域已知的和本文所述进行评估。例如，可以例如通过使用模拟转染的cho或hek细胞的facs分析来确定与靶阴性人细胞系的非特异性结合。在第二个实施例中，可以通过facs分析衍生自相应组织的细胞系或细胞系组来分析与不同组织的非特异性结合。在第三个例子中，免疫细胞群体的非特异性结合可以在本领域已知的免疫细胞群体分类后通过facs进行分析。在第四个例子中可以使用elisa分析bvp、胰岛素或dna的非特异性性结合，如hötzel、isidro hötzel, isidro, et al. "a strategy for risk mitigation ofantibodies with fast clearance." mabs. vol. 4. no. 6. taylor&francis, 2012.;avery, lindsay b., et al. "establishing in vitro in vivo correlations toscreen monoclonal antibodies for physicochemical properties related tofavorable human pharmacokinetics." mabs. vol. 10. no. 2. taylor&francis,2018., 和 jain, tushar, et al. "biophysical properties of the clinical-stageantibody landscape." proceedings of the national academy of sciences 114.5(2017): 944-949所述，其全部内容并入本文，特别是关于分析和量化非特异性结合所需的技术细节。没有实质上非特异性结合的抗体的特征优选地为非特异性结合低于参考抗体gantenerumab（roche）的非特异性结合并且最优选地低于参考抗体remicade（janssenbiotech）的非特性结合。

84、术语“脱靶结合”是指抗体结合不同于预期靶标的单个蛋白的能力，例如靶标蛋白家族的蛋白。可使用本领域已知的商业测定（例如retrogenix脱靶分析测定）来评估脱靶结合。简而言之，抗体是在含有单独表达数千种人膜蛋白和分泌蛋白的hek293细胞的微阵列上测试的。抗体与潜在脱靶的结合必须使用过度表达潜在脱靶的细胞的facs来确认。

85、术语“亲和性”是本领域的术语，并描述了结合物、抗体或抗体片段与靶标之间的结合强度。抗体及其片段对靶标的“亲和力”可以使用本领域公知或本文所述的技术来确定，例如通过elisa、等温滴定量热法（itc）、表面等离子共振（spr）、流式细胞术或荧光偏振测定。优选地，亲和性以解离常数kd提供。

86、“解离常数”（kd）具有摩尔单位（m），并对应于一半靶标蛋白处于平衡状态时的结合物/抗体浓度。解离常数越小，结合物或抗体与其靶标之间的亲和力越高。

87、根据本发明，抗体优选具有至少10-7m（作为kd值）的靶标亲和力，更优选至少10-8m，甚至更优选在10-9m至10-11m的范围内。kd值可优选通过表面等离子体共振光谱法测定，例如本文别处所述。如果发现测定条件影响测定的kd，则应使用标准偏差最小的测定设置。

88、“半最大有效浓度”（ec50）是指在规定的培养时间后，诱导在基线和最大值之间的一半的应答的药物、抗体、片段、缀合物或分子的浓度。在抗体结合的情况下，ec50因此反映了最大结合的一半所需的抗体浓度。如果可以通过描述所应用药物、抗体、片段、缀合物或分子浓度与信号之间的关系的剂量-反应曲线的数学建模（例如，非线性回归）来确定拐点，则可以确定ec50。例如，如果剂量-反应曲线遵循s形曲线，则可以确定ec50。当反应是抑制时，ec50被称为半最大抑制浓度（ic50）。ec80可作必要的修改后确定。

89、“等电点”(pi)是分子不带净电荷或呈电中性时的ph值。

90、术语“抗体”（ab）是指与抗原特异性结合或免疫反应的免疫球蛋白分子，例如但不限于人igg1, igg2, igg3, igg4, igm, igd, ige, iga1, iga2, 小鼠igg1, igg2a,igg2b, igg2c, igg3, iga, igd, ige 或 igm, 大鼠 igg1, igg2a, igg2b, igg2c,iga, igd, ige 或 igm, 兔iga1, iga2, iga3, ige, igg, igm, 山羊 iga, ige, igg1,igg2, ige, igm 或鸡igy。抗体或抗体片段在轻链和重链可变结构域中包含互补决定区（cdr），也称为高变区。可变结构域中高度保守的部分称为框架（fr）。如本领域所知，描绘抗体高变区的氨基酸位置/边界可以根据上下文和本领域已知的各种定义而变化。如本文所用，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据kabat等的免疫球蛋白核酸残基编号系统进行的。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个fr区域。每个链中的三个cdr被fr区紧密地连接在一起，并且与来自另一条链的cdr一起，有助于抗体抗原结合位点的形成，参见kabat, e.a., et al. "sequences of proteins of immunological interest (natl. inst.health, bethesda, md), gpo publ." no165-462 (1987)。本文使用的术语抗体也指抗体片段，除非另有明确说明。根据各自的上下文，术语抗体也可以指具有免疫球蛋白样功能的任何蛋白质结合分子。

91、术语“cdr”是指抗体的互补决定区。如本领域已知的，互补决定区（cdr）是抗体和t细胞受体中可变链的一部分。一组cdr构成一个副表位。cdr对抗原特异性的多样性至关重要。有三个cdr（cdr1、cdr2和cdr3），非连续地排列在抗原受体可变结构域的氨基酸序列上。由于抗原受体通常包含两个可变结构域（在两个不同的多肽链上，重链和轻链），因此每个抗原受体通常有六个cdr可以共同与抗原接触。轻链的cdr是lcdr1、lcdr2和lcdr3。重链的cdr被称为hcdr1、hcdr2和hcdr3。hcdr3是最可变的互补决定区（参见，例如，chothia,cyrus, and arthur m. lesk. "canonical structures for the hypervariableregions of immunoglobulins." journal of molecular biology 196.4 (1987): 901-917.; kabat, e. a., et al. "sequences of proteins of immunological interest.bethesda, md: us department of health and human services." public healthservice, national institutes of health (1991): 103-511）。

92、“恒定区”是指赋予效应子功能的抗体分子部分。重链恒定区可以选自五种同种型中的任何一种：alpha (α), delta (δ), epsilon (ε), gamma (g), or mu (μ)。

93、本文中使用的术语“fc结构域”、“fc区域”或“fc部分”是指包含至少一部分恒定区的抗体重链的c端区域。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。例如，人igg重链fc区可以从cys226或pro230延伸到重链的羧基末端。

94、根据本发明的抗体或结合片段可以被修饰以改变至少一种恒定区介导的生物效应功能。例如，在一些实施方式中，抗体可以被修饰以相对于未修饰的抗体减少或增强至少一种恒定区介导的生物效应功能，例如减少或改善与fc受体（fcγr）的结合。fcγr结合可能会降低，例如，通过突变抗体的免疫球蛋白恒定区片段中用于fcγ受体相互作用的特定区域，（参见，例如，canfield, stephen m., and sherie l. morrison. "the bindingaffinity of human igg for its high affinity fc receptor is determined bymultiple amino acids in the ch2 domain and is modulated by the hinge region."the journal of experimental medicine 173.6 (1991): 1483-1491; and lund, john,et al. "human fc gamma ri and fc gamma rii interact with distinct butoverlapping sites on human igg." the journal of immunology 147.8 (1991):2657-2662）。fcγr结合可能会增强，例如通过去岩藻糖基化(afucosylation)。减少fcγr结合也可能减少依赖于fcγ受体相互作用的其他效应功能，如调理、吞噬和抗原依赖性细胞毒性（“adcc”）。

95、此外，解决fc与fcrn的相互作用允许调节体内抗体的半衰期。通过例如引入突变h435a来消除相互作用导致极短的半衰期，因为抗体不再受到fcrn循环的溶酶体降解的保护。在根据所有方面的一些优选的实施方式中，根据本发明的抗体包含突变h435a或以其他方式被工程化以减少半衰期。

96、相反包含“yte”突变（m252y/s254t/t256e）和/或等同突变（如“ls”突变（m428l/n434s））的抗体已显示，通过从临床前物种和人类的内体中更有效地回收可显著延长半衰期（dall’acqua, william f., et al. "increasing the affinity of a human igg1for the neonatal fc receptor: biological consequences." the journal ofimmunology 169.9 (2002): 5171-5180.; zalevsky, jonathan, et al. "enhancedantibody half-life improves in vivo activity." nature biotechnology 28.2(2010): 157-159）。在根据所有方面的一些优选的实施方式中，根据本发明的抗体包含yte突变（m252y/s254t/t256e）和/或等同突变，例如ls（m428l/n434s），或以其他方式被工程化用于改善半衰期。haraya, kenta, tatsuhiko tachibana, and tomoyuki igawa. "improvement of pharmacokinetic properties of therapeutic antibodies byantibody engineering." drug metabolism and pharmacokinetics 34.1 (2019): 25-41., and/or lee, chang-han, et al. "an engineered human fc domain thatbehaves like a ph-toggle switch for ultra-long circulation persistence."nature communications 10.1 (2019): 1-11可以找到延长半衰期的合适fc工程化方法，均通过引用并入本文。

97、“去岩藻糖基化”抗体是经过工程化的抗体，使得抗体fc区的寡糖不具有任何岩藻糖单元。抗体的糖基化可以改变其功能。例如，如果igg的ch2结构域中n297处的糖基化被完全消除，那么与fcγrs的结合就会丢失。然而，n297处特定碳水化合物组成的调节可具有相反的效果并增强抗体的adcc活性。简而言之，抗体对激活fcγrs的亲和力取决于n297 n-连接寡糖的组成。有32种可能的低聚糖组合可出现在该位置。天然存在的人igg和由杂交瘤或其他常见表达系统产生的人igg通常包含n-乙酰氨基葡萄糖（glcnac）和形成核心碳水化合物的三个甘露糖残基。该核连接到两个额外的glcnac基团以形成双十分支。半乳糖在每个分支的添加以及唾液酸在这些半乳糖分子中的末端添加都可能发生。岩藻糖通常是核心glcnac的一部分。这种岩藻糖通过空间位阻阻碍抗体与fcγriiia的相互作用。因此，消除这种岩藻糖分子同时在该位点保持其他形式的糖基化增加了抗体与活化fcγrs的结合，增强其引发adcc和/或adcp的能力（almagro, juan c., et al. "progress and challengesin the design and clinical development of antibodies for cancer therapy."frontiers in immunology 8 (2018): 1751）。制备无岩藻糖抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤yb2/0细胞中生长（atcc crl 1662）。yb2/0细胞表达低水平的其编码α-1,6-岩藻糖基转移酶（这是多肽岩藻糖化所必需的酶）的fut8 mrna。去岩藻糖基化抗体对于本发明是优选的。

98、“抗体依赖性细胞毒性”（“adcc”），也称为“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”，是一种细胞介导免疫防御机制，通过这种机制，免疫细胞主动裂解膜表面抗原已被特异性抗体结合的靶细胞。adcc通过抗体或片段与fcγriiia的相互作用介导。在人类中，fcγriii以两种不同的形式存在：fcγriiia（cd16a）和fcγri iib（cd16b）。虽然fcγriiia作为跨膜受体在单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上表达，但fcγriiib仅在中性粒细胞上表达。这些受体与igg抗体的fc部分结合，然后激活由人效应细胞介导的抗体依赖性细胞介导细胞毒性（adcc）。文献中已经描述了用于确定人类受试者中adcc诱导的不同测定系统，其适用于本文公开的主题的表征。例如，yao te hsieh等人研究了不同的adcc测定系统，即基于（i）来自人类供体的自然杀伤细胞（fcγriiia+初级nk）的测定，（ii）fcγriiia工程化nk-92细胞和（iii）fcβriiia/nfat-re/luc2工程化jurkat t细胞（hsieh, yao-te, et al. "characterization of fcγriiia effector cells used inin vitro adcc bioassay: comparison of primary nk cells with engineered nk-92and jurkat t cells." journal of immunological methods 441 (2017): 56-66，全部内容并入本文；特别是参考这些测定的方法描述）。简而言之，所有三种效应细胞系统都差异表达fcγriiia，并提供剂量依赖性adcc途径活性，但只有原代nk细胞和工程化nk-92细胞能够诱导adcc介导的细胞裂解。对于adcc活性的功能评估，原代nk或nk-92（v-158）细胞因此更好地反映了生理上相关的adcc作用机制。作为工程化细胞系，nk-92细胞可能比原代nk细胞表现得更具再现性，因此是确定人类受试者adcc反应的优选测定系统，例如在怀疑的情况下。

99、诱导adcc（或具有adcc活性）的抗体或抗原结合片段是在nk效应细胞存在下可引发靶细胞大量裂解的抗体。优选地，adcc诱导导致至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的靶细胞裂解。

100、“抗体依赖性细胞吞噬作用”（“adcp”）是指抗体调理的靶细胞激活巨噬细胞表面的fcγrs以诱导吞噬作用，从而导致靶细胞内化和降解的机制。对于adcp，与作为效应细胞的巨噬细胞的结合通常通过抗体fc部分与巨噬细胞表达的fcγriia（cd32a）的相互作用发生。

101、诱导adcp（或具有adcp活性）的抗体或抗原结合片段是一种可在巨噬细胞存在下引发靶细胞的大量吞噬作用的抗体。优选地，adcp诱导导致至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的靶细胞的吞噬作用。

102、“补体依赖性细胞毒性”（“cdc”）是igg和igm抗体的效应功能。当它们与靶细胞（例如细菌或病毒感染的细胞）上的表面抗原结合时，经典补体途径通过将蛋白c1q与这些抗体结合而触发，从而形成膜攻击复合物（mac）和靶细胞裂解。补体系统被人igg1、igg3和igm抗体有效激活，被igg2抗体弱激活，不被igg4抗体激活。这是治疗性抗体（也是根据本发明的抗体的特定实施方式）可以实现抗肿瘤作用的一种作用机制。存在几种实验室方法来确定cdc的效力，并且在本领域中是已知的。

103、诱导cdc的抗体或抗原结合片段是可引发大量膜攻击复合物形成和靶细胞裂解的抗体。优选地，cdc诱导导致至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%的靶细胞裂解。

104、包含fc区的抗体可以或可以不包含促进fc结构域的第一和第二亚基结合的修饰。

105、“促进fc结构域的第一和第二亚基结合的修饰”是对肽骨架的操纵或fc结构亚基的翻译后修饰，其减少或阻止包含fc结构区亚基的多肽与相同多肽的结合以形成同二聚体。包含fc区的抗体可以或可以不包含促进fc结构域的第一和第二亚基结合的修饰。本文所用的修饰促进结合特别包括对期望结合的两个fc结构域亚基中的每一个（即fc结构的第一和第二亚基）进行的单独修饰，其中所述修饰彼此互补，以促进两个fc结构域亚单位的结合。例如，修饰促进结合可以改变一个或两个fc结构域亚基的结构或电荷，从而使它们的结合在空间上或静电上有利。因此，（异源）二聚发生在这可能是不相同的包含第一fc结构域亚基的多肽和包含第二fc结构亚基的肽之间，例如在融合到每个亚基的其他成分（例如抗原结合部分）不相同的意义上。在一些实施方式中，修饰促进结合包括fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸取代。在一个特定的实施方式中，修饰促进结合在fc结构域的两个亚基中的每一个中包括单独的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。

106、本文所用抗体的“片段”需要基本上保持全长抗体的所需亲和力。因此，抗人ccr8抗体的合适片段将保持与靶趋化因子受体结合的能力，例如与人ccr8受体结合。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab’、f（ab’）2和fv片段、单链抗体分子、双抗体和域抗体，见holt, lucy j., et al."domain antibodies: proteins for therapy." trends in biotechnology 21.11(2003): 484-490。

107、“fab片段”包含轻链的恒定结构域和重链的第一个恒定结构域（ch2）。

108、“fab’片段”与fab片段的不同之处在于在重链ch2结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

109、“f（ab’）片段”是通过f（ab’）2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键断裂产生的。抗体片段的其他化学偶联是本领域普通技术人员已知的。fab和f（ab’）2片段缺乏完整抗体的fc片段，从动物的循环中更快地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合，参见例如wahl, richard l., charles w. parker, and gordon w.philpott. "improved radioimaging and tumor localization with monoclonal f(ab’) 2.”journal of nuclear medicine: official publication, society ofnuclear medicine 24.4 (1983): 316-325。

110、“fv片段”是包含完整靶标识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体以紧密、非共价结合（vh-vl二聚体）而组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。通常，六个cdr赋予抗体抗原结合特异性。然而，在一些情况下，即使是单个可变结构域（或fv的一半，其仅包含三个靶特异性cdr）也可能具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

111、“单链fv”或“scfv”抗体片段包含单个多肽链中抗体的vh和vl结构域。通常，fv多肽还包括vh和vl结构域之间的多肽接头，其使scfv能够形成抗原结合所需的结构。

112、“单域抗体”包含对靶标表现出足够亲和力的单个vh或vl域。在特定实施方式中，单域抗体是骆驼化抗体，参见例如riechmann, lutz, and serge muyldermans. "singledomain antibodies: comparison of camel vh and camelised human vh domains."journal of immunological methods 231.1-2 (1999): 25-38。

113、“双特异性抗体”是对相同或不同抗原上至少两个不同表位具有结合特异性的单克隆抗体。在本公开中，一种结合特异性可针对靶趋化因子受体如ccr8，另一种可针对任何其他抗原，例如但不限于细胞表面蛋白、受体、受体亚基、组织特异性抗原、病毒衍生蛋白、病毒编码的包膜蛋白、细菌衍生蛋白或细菌表面蛋白。根据本发明的双特异性抗体构建体还包括包含多个结合域/结合位点的多特异性抗体构建体，例如三特异性抗体构建体，其中所述构建体包含三个结合域。

114、“衍生抗体”通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、酰胺化、已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接进行修饰。许多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，该衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用wolfson, wendy. "amber codon flashing ambrx augments proteins with unnaturalamino acids." chemistry&biology 13.10 (2006): 1011-1012。根据本发明的抗体可以衍生化，例如糖基化或硫酸化。

115、“单克隆抗体”是结合特定抗原的抗体的基本同质群体。单克隆免疫球蛋白可通过本领域技术人员熟知的方法获得（例如，参见köhler, georges, and cesar milstein. "continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity." nature 256.5517 (1975): 495-497., 和美国专利号 4,376,110）。具有特异结合亲和力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段可以从原核或真核生物中分离、富集或纯化。本领域技术人员已知的常规方法能够在原核和真核生物中产生免疫球蛋白或免疫球蛋白片段和具有免疫球蛋白样功能的蛋白质结合分子。根据本发明的抗体优选是单克隆的。

116、“人源化抗体”包含源自非人类物种（例如小鼠）的cdr区，这些cdr区与任何必要的框架反向突变一起植入人类序列衍生的v区。因此，在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体）的受体的高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种（供体抗体）（例如小鼠、大鼠、或非人灵长类动物）的高变区域的残基取代。例如，参见美国专利号5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205，各自通过引用并入本文。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能（例如，获得期望的亲和力）。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本所有框架区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地包含免疫球蛋白恒定区（fc）的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。有关更多详细信息，请参见jones, peter t.,et al. "replacing the complementarity-determining regions in a human antibodywith those from a mouse." nature 321.6069 (1986): 522-525.; riechmann, lutz,et al. "reshaping human antibodies for therapy." nature 332.6162 (1988): 323-327.; and presta, leonard g. "antibody engineering." current opinion instructural biology 2.4 (1992): 593-596,各自通过引用并入本文。

117、完全人抗体（人抗体）包括人源cdr，即人来源cdr。优选地，根据本发明的全人抗体是与最接近的人vh种系基因（例如从推荐列表中提取并在imgt/domain gap align中分析的序列）具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列同一性的抗体。

118、如2017年前有效的inn物种子系统等常用命名系统所接受的，与基于imgt数据库确定的最接近的人类种系参考相比，全人类抗体可能包含少量种系偏差(http://www.imgt.org，2019年11月29日）。例如，与最接近的人类种系参考相比，根据本发明的全人类抗体可在cdr中包含多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14或15种种系偏差。通过克隆技术结合细胞富集或永生化步骤，可以从人源b细胞中开发出完全人抗体。然而，临床上使用的大多数完全人抗体要么是从针对人igg基因座转基因的免疫小鼠中分离的，要么是通过噬菌体展示从复杂的组合文库中分离的（brüggemann, marianne, et al. "humanantibody production in transgenic animals." archivum immunologiae ettherapiae experimentalis 63.2 (2015): 101-108.; carter, paul j. "potentantibody therapeutics by design." nature reviews immunology 6.5 (2006): 343-357.; frenzel, andré, thomas schirrmann, and michael hust. "phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy." mabs. vol. 8.no. 7. taylor&francis, 2016.; nelson, aaron l., eugen dhimolea, and janice m.reichert. "development trends for human monoclonal antibody therapeutics."nature reviews drug discovery 9.10 (2010): 767-774）。

119、有几种技术可用于产生完全人抗体或产生包含人源cdr的抗体（参见wo2008112640）。剑桥抗体技术公司（cat）和dyax已经从从免疫的人分离的外周b细胞中获得了抗体cdna序列，并设计了噬菌体展示库用于鉴定具有特定特异性的人可变区序列。简言之，抗体可变区序列与m13噬菌体的基因iii或基因viii结构融合。这些抗体可变区序列在携带相应序列的噬菌体末端以fab或单链fv（scfv）结构表达。通过使用不同水平的抗原结合条件（严格性）的多轮筛选过程，可以选择和分离表达对感兴趣抗原特异的fab或scfv结构的噬菌体。然后可以使用标准测序程序来阐明所选噬菌体的抗体可变区cdna序列。然后，这些序列可用于使用已建立的抗体工程技术重建具有所需同种型的完整抗体。根据该方法构建的抗体被认为是完全人类抗体（包括cdr）。为了提高所选抗体的免疫反应性（抗原结合亲和力和特异性），可以引入体外成熟过程，包括不同重链和轻链的组合结合、重链和重链的cdr3处的缺失/添加/突变（以模拟v-j和v-d-j重组），和随机突变（模拟体细胞超突变）。这种方法产生的“全人”抗体的一个实例是抗肿瘤坏死因子α抗体humira（阿达木单抗）。

120、“阿替利珠单抗”（tecentriq）是指另一种pd-l1阻断抗体，同样适用于多种癌症的治疗。其剂型和规格为注射液，以840 mg/14 ml（60 mg/ml）或1200 mg/20 ml（60 mg/ml）的单剂量装于单剂量小瓶中。阿替利珠单抗稀释后可通过静脉输注施用，例如剂量为每两周840 mg、每三周1200 mg或每四周1680 mg。

121、“阿维鲁单抗”（bavencio）是一种靶向pd-l1的全人源单克隆抗体。阿维鲁单抗由merck kgaa研发并用作抗癌药物，例如用于治疗默克尔细胞癌（merkel cell carcinoma）、尿路上皮癌和肾细胞癌。

122、“度伐利尤单抗”（imfinzi）是一种pd-l1阻断抗体，适用于多种癌症类型。其剂型和规格为注射液，以500 mg/10 ml或120 mg/2.4 ml（均为50 mg/ml）的单剂量装于小瓶中。度伐利尤单抗可稀释后通过静脉输注施用，例如，作为联合治疗方案的一部分，剂量为每两周10 mg/kg，或每三周1500 mg。

123、“纳武利尤单抗”（opdivo）是一种pd-1阻断抗体，适用于多种癌症的治疗。其剂型和规格为注射液，以10 mg/ml（4 ml或10 ml）的单剂量装于小瓶中。纳武利尤单抗可稀释后通过静脉输注施用，例如剂量为每两周240mg、每三周360mg或每四周480mg。

124、“帕博利珠单抗”（keytruda）是一种强效人源化igg4单克隆抗体，具有与pd-1受体高度特异性结合的能力，从而抑制pd-1与pd-l1和pd-l2的相互作用。基于临床前体外数据，帕博利珠单抗对pd-1具有高亲和力和强效的受体阻断活性。帕博利珠单抗具有可接受的临床前安全性，目前正作为一种用于治疗晚期恶性肿瘤的静脉（iv）免疫疗法进行临床开发。帕博利珠单抗适用于多种癌症适应症的治疗。帕博利珠单抗的剂型和规格为注射液，以100mg/4 ml（25 mg/ml）的单剂量装于小瓶中。帕博利珠单抗施用的剂量，例如每三周一次200mg，或每六周一次400 mg。小鼠模型的治疗研究表明，阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体的施用可以增强肿瘤特异性cd8+ t细胞的浸润，并最终导致肿瘤排斥，无论是作为单一疗法还是与其他治疗方式联合使用。

125、“特瑞普利单抗”是一种重组人源化pd-1单克隆抗体，其与pd-1结合并阻止pd-1与pd-l1和pd-l2的结合。特瑞普利单抗由上海君实生物医药科技股份有限公司研发，用于治疗多种癌症。特瑞普利单抗的批准剂量为每两周3 mg/kg，静脉（iv）输注。

126、“赛帕利单抗”（arcus biosciences）是一种单克隆抗体，其与pd-1结合，从而恢复t细胞的抗肿瘤活性。正在对赛帕利单抗进行多种癌症适应症的临床研究，例如用于一线治疗转移性非小细胞肺癌，例如与多瓦那利单抗（抗tigit单克隆抗体）和埃曲马德奈（双重a2a/a2b腺苷受体拮抗剂）联合使用。赛帕利单抗可以稀释后通过静脉输注施用，例如剂量为每三周360mg。

127、“治疗”受试者的疾病或“治疗”患有疾病的受试者是指对受试者进行药物治疗，例如施用药物，以减少或防止疾病的至少一种症状恶化。

128、术语“预防（prevent/preventing/prevention）”等指的是减少受试者患疾病、障碍或病症的概率，所述受试者没有疾病、障碍或者病症，但有患疾病、病症或病症的风险或易患疾病、紊乱或者病症。

129、术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，指的是足以达到特定生物学结果或调节或改善受试者症状或症状发作时间的量，通常为至少约10%；通常至少约20%，优选至少约30%，或更优选至少约50%。可以基于肿瘤负荷的变化来评估抗体在癌症治疗中的使用效果。肿瘤收缩（客观反应）和疾病进展的时间都是癌症临床试验的重要终点。标准化应答标准，即recist（实体瘤应答评估标准）于2000年发布。2009年发布了更新（recist1.1）。recist标准通常用于以客观应答为主要研究终点的临床试验，以及评估稳定疾病、进行肿瘤进展或进展时间分析的试验，因为这些结果测量基于对解剖肿瘤负荷及其在试验过程中的变化的评估。特定受试者的有效剂量可能因治疗条件、受试者整体健康、施用方法、途径和剂量以及副作用严重程度等因素而异。当组合时，有效量与组分的组合成比例，并且效果不限于单独的组分。

130、如果未另行定义，“完全缓解”（cr）定义为所有靶病变消失。任何病理性淋巴结（无论是目标淋巴结还是非目标淋巴结）必须在短轴上减少至<10 mm。对于“部分缓解”（pr），必须达到目标病变直径之和的至少30%的减少，以基准总直径为参考。对于“进展性疾病”（pd），以研究中最小的总和作为参考，目标病变直径总和至少增加20%（如果研究中最小，则包括基线总和）。除了相对增加20%外，总和还必须显示出至少5 mm的绝对增加。在“稳定疾病”（sd）中，没有观察到足够的收缩以符合pr的要求，也没有观察到充分的增加以符合pd的要求，将研究期间的最小总和直径作为参考。

131、可用于确定本文所述的本发明抗体的治疗益处的次要结果测量包括以下内容：“客观缓解率”（orr）定义为实现完全缓解（cr）或部分缓解（pr）的受试者比例。“无进展生存期”（pfs）定义为从抗体的第一次给药日期到疾病进展或死亡的时间，以先发生者为准。“总生存期”（os）是指从疾病诊断之日或开始治疗之日起，被诊断患有该疾病的患者仍然活着的时间长度。“总体缓解持续时间”（dor）定义为从参与者的初始cr或pr到疾病进展的时间。“缓解深度”（dpr）定义为与基线肿瘤负荷相比，在最大反应点观察到的肿瘤收缩百分比。orr和pfs的临床终点可根据上述recist 1.1标准确定。

132、在分析非人受试者的情况下，必须如本文其他地方所讨论的那样调整用于确定治疗效果和益处的上述参数，参见实施例12ff。

133、根据本发明的典型“受试者”包括人类和非人类受试者。受试者可以是哺乳动物，如小鼠、大鼠、猫、狗、灵长类动物和/或人类。

134、如本文所用，术语“药物制剂”（也称“药物组合物”、“治疗制剂”或“剂型”）是指可用于受试者或患者的活性成分和非活性化合物的混合物。例如，药物制剂可通过将具有所需纯度的抗体、抗体片段或偶联物与生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合制备，例如，参见remington's pharmaceutical sciences (18th ed.; mack pub. co.: eaton,pa., 1990）。药物制剂中可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对受试者无毒。

135、对于不通的施用途径，有多种不同的制剂类型，例如肠内制剂、肠外制剂或局部制剂。

136、“肠内制剂”包括但不限于片剂、胶囊或缓释制剂。

137、“肠外制剂”包括但不限于液体制剂或冻干制剂。

138、“局部制剂”包括但不限于乳膏、软膏、凝胶、糊剂和粉剂。

139、“液体”或“液体（药物）制剂”包含活性成分且通常还包含其他化合物，以确保药物在储存后保持稳定。这些其他化合物包括但不限于增溶剂、稳定剂、缓冲剂、渗透压调节剂、填充剂、增稠剂/减稠剂、表面活性剂、螯合剂和佐剂。如果通过蒸发浓缩，液体制剂可以在施用前进一步稀释。对于iv施用，可以将液体制剂从药瓶转移到输液袋中，并可与其他化合物或物质混合。

140、“冷冻液体”是指处于固态的液体制剂，例如，液体制剂通过冷冻转化为固态。

141、“冻干制剂”（也称冻干产物）是通过去除液体药物或液体制剂中的溶剂（例如水）而得到的固体粉末或块状物。冻干制剂稳定性好，可长期保存，并可在较高温度下储存。可添加稳定剂以替代水/溶剂，并保持抗体或其片段的结构。施用前，通常将冻干制剂复溶成液体。这可以通过将液体稀释剂（可包含或不包含其他成分）与冻干制剂混合或以其他方式重新悬浮。

142、如果用溶剂稀释后得到的液体具有以下特定成分浓度，则冻干产物“被安排稀释至进一步的特定浓度”。

143、如本文所用，术语“组氨酸”是指必需氨基酸“组氨酸”或其盐类，例如但不限于组氨酸碱性组分和组氨酸盐酸盐一水合物。组氨酸包含α-氨基（其可能以质子化的-nh3+形式存在）、羧基（其可能以去质子化的-coo-形式存在）和咪唑侧链（可能部分质子化）。组氨酸可用作药物制剂的组成部分。“l-组氨酸”是氨基酸组氨酸的l-对映异构体，例如指l-组氨酸碱性组分和l-组氨酸盐酸盐一水合物。

144、术语“精氨酸”是指氨基酸“精氨酸”或其盐类，例如盐酸精氨酸。精氨酸含有α-氨基、羧基和胍基。精氨酸可用作药物制剂的组成部分。“l-精氨酸”是氨基酸精氨酸的l-对映异构体。

145、术语“甲硫氨酸”是指必需氨基酸“甲硫氨酸”或其盐。甲硫氨酸包含α-氨基、羧基和s-甲基硫醚侧链。甲硫氨酸可用作药物制剂的组成部分。“l-甲硫氨酸”是氨基酸甲硫氨酸的l-对映异构体。

146、“聚山梨醇酯80”聚乙氧基化山梨糖醇酐与油酸衍生而来，其商品名为tween 80。该化合物中的亲水基团为聚醚（亦称聚氧乙烯基团），即环氧乙烷的聚合物。在聚山梨酯的命名体系中，紧随“聚山梨酯”之后的数字表示亲脂基团，在本例中为油酸。聚山梨酯80的完整化学名称为：聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯，或 (x)-山梨糖醇酐单-9-十八碳烯酸酯聚(氧-1,2-乙二基)。

147、“蔗糖”（也称“(2r,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2s,3s,4s,5r)-3,4-二羟基-2,5-双(羟甲基)氧杂环戊烷-2-基]氧基}-6-(羟甲基)氧杂环戊烷-3,4,5-三醇” 或“β-d-呋喃果糖基α-d-吡喃葡萄糖苷”）是一种二糖。在蔗糖中，葡萄糖单体和果糖通过葡萄糖亚基上的c1和果糖亚基上的c2的醚键连接。包含6%蔗糖的药物溶液包含约175 mm蔗糖，而包含8%蔗糖的药物溶液含有约234 mm蔗糖。

148、“静脉注射”或“静脉输注”是指将液体（包括药物组合物或药物）注入血液的方法。

149、“皮下施用”、“皮下输注”是指通过注射或输注将药物、药物组合物或药品插入皮肤下的方法。

150、术语“葡萄糖水溶液”是指水溶液（例如水或生理盐水（0.9% w/v nacl））中的右旋糖（葡萄糖）溶液。该溶液有多种浓度，包括5%（d5w）、10%和50%的右旋糖。百分比可以是质量体积百分比，例如，5%溶液包含50 g/l葡萄糖/右旋糖，相当于278 mmol/l的葡萄糖。

151、“宿主细胞”是用来接收、维持、繁殖和扩增载体的细胞。宿主细胞也可用于表达多肽，例如由载体编码的抗体或其片段。当宿主细胞分裂时，载体中包含的核酸被复制，从而扩增核酸。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho细胞或hek细胞。进一步优选的宿主细胞是大鼠骨髓瘤yb2/0细胞。

152、“具有内源性靶表达的细胞”是指在与生理或疾病情况相当的水平上表达靶蛋白的细胞。通常，经过过表达工程化改造的细胞表达的靶蛋白水平要高得多。

153、在细胞、结构、蛋白质、抗体或标志物的上下文中，术语“瘤内”、“瘤内的”、“肿瘤浸润的”或“肿瘤的”是指它们在肿瘤组织中的定位。

154、对某种标志物或蛋白质“阳性”或“+”的细胞是以该标志物或蛋白的大量表达为特征的细胞。标志物或蛋白质表达可以如本领域已知的那样测定和定量，例如定义不同的细胞群体。对于（免疫）细胞群的表征，标志物表达可以通过facs或使用本文所述的任何其他技术来确定。

155、“t细胞”是表达tcrαβ、cd3和cd8或cd4的免疫细胞。如本文所用，该术语包括幼稚t细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞，调节性t细胞、记忆t细胞、激活的t细胞、无能t细胞、耐受t细胞、嵌合b细胞和抗原特异性t细胞以及本领域已知的其他t细胞群体，细胞表面上t细胞受体（tcr）的存在将t细胞与其他淋巴细胞区分开来。

156、cd8+t细胞”（也称为“细胞毒性t细胞”、“tc”、“细胞毒性t淋巴细胞”、“ctl”、“t杀伤细胞”、“细胞溶解性t细胞”、”cd8+t淋巴细胞“或”杀伤性t细胞”）是表达cd3、cd45和cd8的t细胞。cd8+t可以杀死癌细胞、被感染的细胞（特别是被病毒感染的细胞）或其他受损细胞。

157、“cd4+t细胞”（也称为“辅助性t细胞”、“th细胞”）是表达cd3、cd4和cd45的免疫细胞。辅助性t细胞有几个亚群，例如但不限于th1、th2和th17。cd4+t淋巴细胞有助于抑制或调节免疫反应。它们在b细胞抗体类别转换、细胞毒性t细胞的激活和生长以及最大化吞噬细胞（如巨噬细胞）的杀菌活性中至关重要。

158、如本文所用，术语“treg细胞”（也称为“tregs”、“调节性t细胞”、“t调节性细胞”、“抑制性t细胞”）是指表达cd3、cd4、cd45和foxp3的免疫细胞，此外还表达高水平的cd25和低水平的cd127。treg细胞的鉴定可如本文其他地方所述进行。treg细胞通常也表达高水平的ctla-4、gitr和lag-3。在文献中，treg还根据记忆标志物cd45ro进行了分类。

159、在生理条件下，treg细胞保持免疫耐受。在免疫应答过程中，treg细胞停止t细胞介导的免疫，并抑制胸腺内逃脱阴性选择的自身反应性t细胞。treg细胞还可以抑制其他类型的免疫细胞，如nk细胞和b细胞。适应性treg细胞（称为th3或tr1细胞）被认为是在免疫应答期间产生的。

160、treg细胞还通过抑制抗肿瘤免疫在免疫逃逸中发挥重要作用，从而提供免疫耐受环境。识别癌细胞的t细胞通常在肿瘤中大量存在，但其细胞毒性功能被附近的免疫抑制细胞抑制。tregs在许多不同的癌症中都很丰富，在肿瘤微环境中高度富集，并因其在肿瘤进展中的作用而广为人知。

161、“激活的treg细胞”表达cd4、cd45、foxp3、cd69和ccr8，此外，cd25高表达，cd127低表达。cd69是t细胞激活标志物。

162、“ccr8阳性调节性t细胞”或“ccr8+调节性t淋巴细胞”是表达ccr8的tregs。

163、“cd4conv细胞”是传统的cd4+、cd25-t细胞。

164、“b细胞”是表达cd19的免疫细胞，成熟的b细胞表达cd20和cd22。通过cd40激活后，b细胞发生分化，发生体细胞超突变和增强的免疫球蛋白类转换，形成成熟的b淋巴细胞或浆细胞（能够分泌abs）。b细胞参与适应性免疫系统的体液免疫，是抗原呈递细胞。

165、“巨噬细胞”是表达低cd14、高cd16、cd11b、cd68、cd163和cd206的免疫细胞。巨噬细胞通过吞噬作用吞噬和消化细胞碎片、外来物质、微生物或癌细胞。除了吞噬作用，巨噬细胞在先天免疫中起着关键作用，并通过招募其他免疫细胞来帮助启动适应性免疫。例如，巨噬细胞作为t细胞的抗原呈递者很重要。促进炎症的巨噬细胞被称为m1巨噬细胞，而减少炎症并促进组织修复的巨噬细胞则被称为m2巨噬细胞。

166、如本文所用，“m1巨噬细胞”是表达acod1的巨噬细胞的子集。m1巨噬细胞具有促炎、杀菌和吞噬功能。

167、如本文所用，“m2巨噬细胞”是表达mrc1（cd206）的巨噬细胞的子集。m2巨噬细胞分泌抗炎性白细胞介素，在伤口愈合中发挥作用，是血运重建和上皮细胞再分化所需的。肿瘤相关巨噬细胞主要具有m2表型，似乎积极促进肿瘤生长。

168、“树突状细胞”（dc）是骨髓来源的白细胞，是最有效的抗原呈递细胞。树突状细胞专门用于捕获和处理抗原，将蛋白质转化为t细胞识别的主要组织相容性复合体（mhc）分子上的肽。如本文所定义，dc的特征在于cd1c、cd14、cd16、cd141、cd11c和cd123的表达。存在不同的树突状细胞亚群。在人类中，dc1是免疫原性的，而dc2细胞是耐受性的。成熟dc表达cd83，而浆细胞样dc表达cd123。

169、“nk细胞”（也是自然杀伤细胞）是表达cd45、cd16、cd56、nkg2d但cd3阴性的免疫细胞。nk细胞不需要激活来杀死缺失mhc 1类“自身”标志物的细胞。ncr1（也称为cd335或nkp46）在nk细胞和nkt细胞的子集上表达。

170、“自然杀伤t（nkt）细胞”是一组具有t细胞和自然杀伤细胞特性的异质t细胞。

171、如本领域所知，“效应细胞”是在刺激后主动支持免疫反应的免疫细胞。如本文所用，效应细胞是指表达fcγ受体的免疫细胞，因此能够介导adcc或adcp。效应细胞的非限制性实例是单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞，优选巨噬细胞和自然杀伤细胞。

172、给药方案采用本领域内已知的缩写形式表示，例如每日一次（qd）、每两天一次（q2d）或每三天一次（q3d）。

173、毛细管等电聚焦（cief）是一种高分辨率分析技术，它允许基于等电点（pi）分离蛋白质/肽混合物、蛋白质糖型和其他带电变体。cief基于毛细管凝胶电泳（cge）的原理。通常，电泳是一种基于带电分子在电场作用下向相反电荷电极迁移的分离技 术。为了根据pi分离分子，通过两性电解质混合物在凝胶内建立ph梯度。目标分子沿着电场迁移，直至到达与其pi对应的ph值，此时其净电荷为零，停止迁移。在整个分离过程测量整个毛细管的uv吸收，以实现实时观察和最终定量分析。cief可用于监测治疗性（糖）蛋白或抗体的电荷异质性以及氧化和脱酰胺分析，以及用于产品表征或可比性研究。

174、毛细管凝胶电泳（cge）可用于蛋白质分子量的定性分析以及蛋白聚集体和片段的定量分析。cge是sds-page技术的高分辨率自动化改进版。通常，电泳是一种基于带电分子在电场作用下向相反电荷电极迁移的分离技术。电泳通常在聚丙烯酰胺凝胶中进行。在cge中，凝胶位于毛细管内，样品组分必须在毛细管内迁移。分子量越大，迁移时间越长。检测系统（通常为uv或荧光检测）用于检测和定量迁移的物质。对于单克隆抗体，cge可在还原或非还原条件下进行。还原条件的优势在于可以提高分辨率，以及检测通过二硫键与mab结合的片段。非还原分析可以提供片段（例如游离轻链和hhl）的更多信息。非还原条件还可以分离共价聚集体。

175、“尺寸排阻高效液相色谱法”（se-hplc）是一种色谱技术，其利用色谱柱中的多孔颗粒，根据溶液中分子的大小分离分子。se-hplc可用于单克隆抗体分析中聚集体、单体和片段的分离。

176、“渗透度”被定义为每千克溶剂中溶质的渗透压数（osm/kg或osm/kg）。因此，数值越大，表示血浆中溶质浓度越高。渗透度是注射剂制剂的关键属性。理想的产品与生理渗透压条件相匹配。此外，渗透度还可以确认溶液中的可溶性物质含量。防止注射低渗或高渗溶液是肠外制剂开发的关键要素。单克隆抗体（mab）制剂的渗透度通常使用冰点降低法或蒸汽压渗透压计测量。

技术实现思路