双碱性蛋白酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及双碱性蛋白酶，具体而言，涉及一种双碱性蛋白酶突变体及其应用。

背景技术：

1、双碱性蛋白酶kex2（ec 3.4.21.61）是一种钙依赖性的丝氨酸蛋白酶，广泛存在于酵母等真核生物中，专一性识别并切割前体蛋白中成对碱性氨基酸残基（如lys-arg↓、arg-arg↓、pro-arg↓）羧基端的肽键，是蛋白质分泌途径中关键的加工酶。其在生物制药领域具有不可替代的应用价值，尤其在重组胰岛素、glp-1类似物、生长激素等多肽类药物的生产过程中，kex2被广泛用于切除融合蛋白或前体蛋白中的信号肽或连接肽，从而高效生成具有生物活性的成熟蛋白。

2、目前，工业上应用的kex2编码基因主要来源于酿酒酵母（

saccharomyces

cerevisiae），重组蛋白通过毕赤酵母（

pichia pastoris）的异源表达获得。然而，现有商业化kex2酶在实际生产中面临多重技术瓶颈：

3、1）催化效率低下，导致酶耗量大，在添加表面活性剂的反应中几乎不会进行酶切反应、反应时间长，通常需要24 h或更长的处理时间、生产成本高昂，严重制约了多肽类药物的大规模、高经济性生产。

4、2）稳定性差、环境适应性弱：在实际生产过程中，为提高目标蛋白的溶解度、缩小酶切体系以及减少溶剂用量，常需在裂解或纯化体系中添加表面活性剂（如sds、triton x-100、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠或月桂酰肌氨酸）、变性剂（如尿素、盐酸胍）或高离子强度缓冲液。然而，天然型kex2在上述条件下极易失活，显著限制了其在一步法酶切工艺中的应用。

5、3）表达量低与纯化成本高：尽管毕赤酵母系统可实现高密度发酵，但野生型kex2因存在n端和c端非功能性序列，表达后易发生错误折叠、聚集或分泌效率低下，导致胞外表达水平低，纯化收率差，进一步推高了单位酶的成本。

6、此外，现有文献与专利（如cn104673988a、us20150184201a1）虽提及kex2在胰岛素原加工中的应用，但均未公开能同时实现高比活力和表面活性剂耐受性的工程化突变体。

7、因此，亟需一种经理性设计、结构导向的kex2工程化改造策略，通过精准筛选关键突变位点并构建多重协同突变体，显著提升其催化效率、环境适应性与工业适用性，从而为多肽药物的低成本、高效率生产提供全新技术路径。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种双碱性蛋白酶突变体及其应用，以解决现有技术中双碱性蛋白酶催化效率低和表面活性剂耐受性差的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种双碱性蛋白酶突变体，该双碱性蛋白酶突变体包括：

3、（a）在seq id no：1所示的氨基酸序列基础上，缺失第1-21位和第678-777位氨基酸且具有如下至少一个氨基酸位点的替换：k252、p255、m285、q286、k438、i531、m546、k114、i253、d257、l260、a279、n281、l457、p461、v489或i573，同时具有双碱性蛋白酶功能的蛋白质；

4、（b）在seq id no：1所示的氨基酸序列基础上缺失第1-21位和第678-777位氨基酸，且具有双碱性蛋白酶功能的蛋白质；

5、其中，在（a）或（b）中，发生替换的氨基酸位点的位置的定义方式是以seq id no：1的第1位氨基酸为第1位进行顺序排列的。

6、进一步地，上述（a）中，上述氨基酸位点的替换选自如下至少一个位点：

7、k252f或k252r或k252h或k252g或k252a或k252v或k252l或k252i或k252p或k252m或k252n、p255d或p255g或p255a或p255v或p255l或p255i或p255m或p255f或p255y或p255w或p255s或p255c或p255t或p255n或p255q或p255e、m285l或m285g或m285a或m285v或m285i或m285p、q286e或q286s或q286c或q286t或q286n或q286d或q286k或q286r或q286h或q286g或q286a或q286v或q286l或q286i或q286p或q286m、k438l或k438r或k438h或k438g或k438a或k438v或k438i或k438p或k438m、i531c或i531s或i531t或i531n或i531q或i531f或i531y或i531w或i531g或i531a或i531v或i531l或i531p或i531m、m546l或m546g或m546a或m546v或m546i或m546p、k114h或k114g或k114a或k114v或k114l或k114i或k114p或k114m、i253g或i253a或i253v或i253l或i253p或i253m或i253s或i253c或i253t或i253n或i253q、d257e或d257s或d257c或d257t或d257n或d257q或d257g或d257a或d257v或d257l或d257i或d257m、l260k或l260r或l260h或l260g或l260a或l260v或l260i或l260p或l260m、a279g或a279v或a279l或a279i或a279p或a279m或a279s或a279c或a279t或a279n或a279q或a279d或a279e、n281d或n281e或n281s或n281c或n281t或n281n或n281q、l457s或l457c或l457t或l457n或l457q或l457g或l457a或l457v或l457i或l457p或l457m、p461k或p461r或p461h或p461g或p461a或p461v或p461l或p461i或p461m、v489c或v489s或v489t或v489n或v489q或v489g或v489a或v489l或v489i或v489p或v489m或i573s或i573c或i573t或i573n或i573q或i573k或i573r或i573h或i573g或i573a或i573v或i573l或i573p或i573m；

8、其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸。

9、进一步地，上述（a）中，上述氨基酸位点的替换包括如下任意一种：

10、k114h、k114g、k114a、k114v、k114l、k114i、k114p、k114m、k252r、k252h、k252g、k252a、k252v、k252l、k252i、k252p、k252m、k252n、k252f、i253g、i253a、i253v、i253l、i253p、i253m、i253s、i253c、i253t、i253n、i253q、p255g、p255a、p255v、p255l、p255i、p255m、p255f、p255y、p255w、p255s、p255c、p255t、p255n、p255q、p255d、p255e、d257e、d257s、d257c、d257t、d257n、d257q、d257g、d257a、d257v、d257l、d257i、d257m、l260k、l260r、l260h、l260g、l260a、l260v、l260i、l260p、l260m、a279g、a279v、a279l、a279i、a279p、a279m、a279s、a279c、a279t、a279n、a279q、a279d、a279e、n281d、n281e、n281s、n281c、n281t、n281n、n281q、m285g、m285a、m285v、m285l、m285i、m285p、q286s、q286c、q286t、q286n、q286d、q286e、q286k、q286r、q286h、q286g、q286a、q286v、q286l、q286i、q286p、q286m、k438r、k438h、k438g、k438a、k438v、k438l、k438i、k438p、k438m、l457s、l457c、l457t、l457n、l457q、l457g、l457a、l457v、l457i、l457p、l457m、p461k、p461r、p461h、p461g、p461a、p461v、p461l、p461i、p461m、v489c、v489a、v489s、v489t、v489n、v489q、v489g、v489l、v489i、v489p、v489m、i531s、i531c、i531t、i531n、i531q、i531f、i531y、i531w、i531g、i531a、i531v、i531l、i531p、i531m、m546g、m546a、m546v、m546l、m546i、m546p、i573s、i573c、i573t、i573n、i573q、i573k、i573r、i573h、i573g、i573a、i573v、i573l、i573p、i573m、k252f+p255d、k252f+m285l、k252f+q286e、k252f+k438l、k252f+i531c、k252f+m546l、p255d+m285l、p255d+q286e、p255d+k438l、p255d+i531c、p255d+m546l、m285l+q286e、m285l+k438l、m285l+i531c、m285l+m546l、q286e+k438l、q286e+i531c、q286e+m546l、k438l+i531c、k438l+m546l、i531c+m546l、k252f+p255d+m285l、k252f+p255d+q286e、k252f+p255d+k438l、k252f+p255d+i531c、k252f+p255d+m546l、k252f+m285l+q286e、k252f+m285l+k438l、k252f+m285l+i531c、k252f+m285l+m546l、k252f+q286e+k438l、k252f+q286e+i531c、k252f+q286e+m546l、k252f+k438l+i531c、k252f+k438l+m546l、k252f+i531c+m546l、p255d+m285l+q286e、p255d+m285l+k438l、p255d+m285l+i531c、p255d+m285l+m546l、p255d+q286e+k438l、p255d+q286e+i531c、p255d+q286e+m546l、p255d+k438l+i531c、p255d+k438l+m546l、p255d+i531c+m546l、m285l+q286e+k438l、m285l+q286e+i531c、m285l+q286e+m546l、m285l+k438l+i531c、m285l+k438l+m546l、m285l+i531c+m546l、q286e+k438l+i531c、q286e+k438l+m546l、q286e+i531c+m546l、k438l+i531c+m546l、k252f+p255d+m285l+q286e、k252f+p255d+m285l+k438l、k252f+p255d+m285l+i531c、k252f+p255d+m285l+m546l、k252f+p255d+q286e+k438l、k252f+p255d+q286e+i531c、k252f+p255d+q286e+m546l、k252f+p255d+k438l+i531c、k252f+p255d+k438l+m546l、k252f+p255d+i531c+m546l、k252f+m285l+q286e+k438l、k252f+m285l+q286e+i531c、k252f+m285l+q286e+m546l、k252f+m285l+k438l+i531c、k252f+m285l+k438l+m546l、k252f+m285l+i531c+m546l、k252f+q286e+k438l+i531c、k252f+q286e+k438l+m546l、k252f+q286e+i531c+m546l、k252f+k438l+i531c+m546l、p255d+m285l+q286e+k438l、p255d+m285l+q286e+i531c、p255d+m285l+q286e+m546l、p255d+m285l+k438l+i531c、p255d+m285l+k438l+m546l、p255d+m285l+i531c+m546l、p255d+q286e+k438l+i531c、p255d+q286e+k438l+m546l、p255d+q286e+i531c+m546l、p255d+k438l+i531c+m546l、m285l+q286e+k438l+i531c、m285l+q286e+k438l+m546l、m285l+q286e+i531c+m546l、m285l+k438l+i531c+m546l、q286e+k438l+i531c+m546l、k252f+p255d+m285l+q286e+k438l、k252f+p255d+m285l+q286e+i531c、k252f+p255d+m285l+q286e+m546l、k252f+p255d+m285l+k438l+i531c、k252f+p255d+m285l+k438l+m546l、k252f+p255d+m285l+i531c+m546l、k252f+p255d+q286e+k438l+i531c、k252f+p255d+q286e+k438l+m546l、k252f+p255d+q286e+i531c+m546l、k252f+p255d+k438l+i531c+m546l、k252f+m285l+q286e+k438l+i531c、k252f+m285l+q286e+k438l+m546l、k252f+m285l+q286e+i531c+m546l、k252f+m285l+k438l+i531c+m546l、k252f+q286e+k438l+i531c+m546l、p255d+m285l+q286e+k438l+i531c、p255d+m285l+q286e+k438l+m546l、p255d+m285l+q286e+i531c+m546l、p255d+m285l+k438l+i531c+m546l、p255d+q286e+k438l+i531c+m546l、m285l+q286e+k438l+i531c+m546l、k252f+p255d+m285l+q286e+k438l+i531c、k252f+p255d+m285l+q286e+k438l+m546l、k252f+p255d+m285l+q286e+i531c+m546l、k252f+p255d+m285l+k438l+i531c+m546l、k252f+p255d+q286e+k438l+i531c+m546l、k252f+m285l+q286e+k438l+i531c+m546l、p255d+m285l+q286e+k438l+i531c+m546l或k252f+p255d+m285l+q286e+k438l+i531c+m546l。

11、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种基因，该基因编码上述的双碱性蛋白酶突变体。

12、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种表达载体，该表达载体包含上述的基因。

13、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括上述的基因或上述的表达载体。

14、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种制备多肽药物的方法，该方法包括：采用上述的双碱性蛋白酶突变体催化多肽药物前体蛋白，得到上述多肽药物；其中，上述多肽药物前体蛋白含有成对碱性氨基酸识别位点。

15、进一步地，上述多肽药物前体蛋白包括如下任意一种或多种：glp-1前体、glp-1衍生物前体、胰淀素前体或胰岛素原。

16、进一步地，上述glp-1衍生物包括如下任意一种：司美格鲁肽或利拉鲁肽；上述胰淀素为普兰林肽。

17、进一步地，上述双碱性蛋白酶突变体在催化体系下催化上述多肽药物前体蛋白，

18、其中，上述催化体系包括上述双碱性蛋白酶突变体、上述多肽药物前体蛋白、可选的表面活性剂和可选的变性剂；

19、其中，上述表面活性剂包括如下任意一种或多种：sds、triton x-100、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠或月桂酰肌氨酸；

20、上述变性剂包括如下任意一种或多种：尿素或盐酸胍。

21、进一步地，上述sds的终浓度为0.05-2%；上述triton x-100的终浓度为0.1-2%；上述脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠的终浓度为0.5-2%；上述月桂酰肌氨酸的终浓度为0.5-2%；上述尿素的终浓度为0.1-8.0 m；上述盐酸胍的终浓度为0.1-6.0 m。

22、为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述的双碱性蛋白酶突变体或上述的基因或上述的表达载体或上述的宿主细胞或上述的制备多肽药物的方法在制备多肽药物中的应用。

23、为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了一种突变体库，该突变体库含有本发明第一个方面的双碱性蛋白酶突变体。

24、应用本发明的技术方案，通过对来源于毕赤酵母的双碱性蛋白酶kex2（seq idno：1）进行截短和定点突变，获得在k252、p255、m285、q286、k438、i531、m546、k114、i253、d257、l260、a279、n281、l457、p461、v489或i573等至少一个位点发生氨基酸替换的突变体，此类突变体保留了kex2对成对碱性氨基酸位点的特异性切割功能，且其催化活性和在复杂环境（例如，表面活性剂）中的稳定性显著提升，为工业级蛋白前体加工提供了高效率、低用量的催化工具。