一种抗DLL3的纳米抗体、相关产品和用途的制作方法

本技术涉及生物医药，特别是涉及一种抗dll3的纳米抗体、相关产品和用途。

背景技术：

1、重链抗体（heavy chain antibody，hcab）发现于骆驼和鲨鱼类动物体内，是一种天然缺失轻链，只有重链组成的抗体。克隆其可变区可以得到只有重链可变区组成的单域抗体，称为vhh（variable domain of heavy chain of heavy chain antibody），也称为纳米抗体（nanobody），它是最小的功能性抗原结合片段。与普通抗体不同，纳米抗体是一条含有大约110个氨基酸的肽链，其分子量约为普通抗体的1/10，纳米抗体与普通抗体及重组单链抗体（single chain fragment variable，scfv）相比，具有分子小、稳定性好、可溶性好、易于表达、生产成本低等优点，在免疫实验、诊断与治疗中，具有广阔的应用前景。

2、据报道，全世界范围内，肺癌是死亡率最高的癌种，2020年大约死亡180万例（18%）。肺癌按病理类型划分为小细胞肺癌（sclc）和非小细胞癌（nsclc），两者分别约占肺癌的15%和85%。小细胞肺癌（sclc）是一种高度致命性和侵袭性的神经内分泌肿瘤。由于小细胞肺癌（sclc）对化疗和放疗高度敏感，因此化疗和放疗联合治疗已成为小细胞肺癌所有阶段公认的标准治疗方法，但预后极差，5年内的生存率小于5%。

3、近年来，免疫治疗在非小细胞肺癌和其他类型癌症的临床治疗中取得了巨大的成功。然而，小细胞肺癌（sclc）免疫治疗的进展却未达到令人满意的效果。因此，迫切需要寻找其他更有效的免疫疗法。

4、δ样蛋白3（dll3）存在于notch信号通路中，是一种抑制性配体以及高度肿瘤选择性蛋白，notch通路在小细胞肺癌（sclc）中发挥着抑癌作用，并在小细胞肺癌（sclc）等神经内分泌肿瘤中表达。由于δ样蛋白3（dll3）在小细胞肺癌（sclc）的肿瘤细胞表面高表达，而在正常成人组织中几乎不表达，因此dll3被认为是sclc免疫疗法中非常有吸引力的靶点。

5、saunders等人发现δ样蛋白3（dll3）在小细胞肺癌（sclc）和大细胞神经内分泌癌（lcnec）肿瘤细胞表面高表达，因此靶向δ样蛋白3（dll3）的adc（抗体-药偶联物），sc16ld6.5，可以有效根除sclc和lcnec pdx（患者来源的异种移植物）肿瘤中表达dll3的肿瘤起始细胞（tic）。furuta m等人证明了dll3通过调节snai1/snail来促进sclc模型中的肿瘤生长、迁移和侵袭。靶向dll3/cd3的双特异性抗体，amg 757，用于增加免疫细胞，促进sclc肿瘤细胞凋亡。amg 757目前正在sclc患者的1期临床研究（nct03319940）中进行评估。综上所述，dll3可作为sclc免疫治疗的靶点。

6、探索针对dll3的嵌合抗原受体t细胞（car-t）用于小细胞肺癌（sclc）的治疗，有望为小细胞肺癌（sclc）治疗带来更多选择，对于治疗小细胞肺癌（sclc）具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本技术的目的在于提供一种抗dll3的纳米抗体、相关产品和用途，本技术的抗dll3的纳米抗体具有较高亲和力，能够作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域制备car-t细胞，所得car-t细胞在肿瘤治疗方面具有较好的应用前景，用于解决现有技术中的问题。

2、为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

3、本技术的第一方面提供一种抗dll3的纳米抗体，所述纳米抗体包括包含cdr1、cdr2和cdr3的重链可变区，

4、所述cdr1的氨基酸序列如seq id no.1-seq id no.6其中之一所示序列；

5、所述cdr2的氨基酸序列如seq id no.7-seq id no.12其中之一所示序列；

6、所述cdr3的氨基酸序列如seq id no.13-seq id no.18其中之一所示序列。

7、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.7所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.13所示序列。

8、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.8所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.14所示序列。

9、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.9所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.14所示序列。

10、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.3所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.10所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.15所示序列。

11、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.9所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.16所示序列。

12、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.4所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.8所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.16所示序列。

13、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.5所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.11所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.17所示序列。

14、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.1所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.9所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.14所示序列。

15、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.6所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.12所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.18所示序列。

16、在某些实施方式中，所述cdr1的氨基酸序列包括seq id no.2所示序列，cdr2的氨基酸序列包括seq id no.9所示序列，cdr3的氨基酸序列包括seq id no.13所示序列。

17、在某些实施方式中，还包括框架区fr1-fr4：所述框架区fr1的氨基酸序列包括如seq id no.19-seq id no.22其中之一所示序列，所述框架区fr2的氨基酸序列包括如seqid no.23-seq id no.27其中之一所示序列，所述框架区fr3的氨基酸序列包括如seq idno.28-seq id no.33其中之一所示序列，所述框架区fr4的氨基酸序列包括如seq idno.34或seq id no.35所示序列。

18、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.19所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.23所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.29所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

19、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.20所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.29所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

20、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.21所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.30所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

21、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.22所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.25所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.31所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.35所示序列。

22、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.21所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.30所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

23、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.20所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.29所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

24、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.20所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.26所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.32所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

25、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.21所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.30所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

26、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.21所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.27所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.33所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

27、在某些具体的实施方式中，所述框架区fr1的氨基酸序列包括seq id no.21所示序列，框架区fr2的氨基酸序列包括seq id no.24所示序列，框架区fr3的氨基酸序列包括seq id no.30所示序列，框架区fr4的氨基酸序列包括seq id no.34所示序列。

28、在某些实施方式中，所述重链可变区的序列包括a1）或a2）：

29、a1）如seq id no.36-seq id no.45其中之一所示的氨基酸序列；

30、a2）与a1）所示的氨基酸序列具有至少80％以上同源性、且具有a1）所限定的氨基酸序列功能的氨基酸序列。

31、本技术的第二方面提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞外域包含如第一方面所述的纳米抗体。

32、在某些实施方式中，所述跨膜域选自cd8α、cd28和dap10中的一种。

33、在某些实施方式中，所述胞内域包括信号结构域或共刺激结构域。

34、在某些具体的实施方式中，所述共刺激结构域选自4-1bb、cd28、ox40、icos和dap10中的一种或多种。

35、在某些具体的实施方式中，所述信号结构域选自cd3ζ。

36、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括铰链区。

37、在某些具体的实施方式中，所述铰链区选自cd8α。

38、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体自n端至c端依次包括所述的纳米抗体、跨膜域和胞内域α。

39、在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

40、在某些具体的实施方式中，所述信号肽选自cd8α信号肽。

41、本技术的第三方面提供一种分离的多核苷酸，编码如第一方面所述的纳米抗体或如第二方面所述的嵌合抗原受体。

42、在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸的核酸序列包括如seq id no.46-seqid no.55其中之一所示序列。

43、本技术的第四方面提供一种构建体，包含有如第三方面所述的分离的多核苷酸。

44、本技术的第五方面提供一种细胞，包含有如第四方面所述的构建体或基因组中整合有如第三方面所述的分离的多核苷酸。

45、本技术的第六方面提供如第一方面所述的纳米抗体或如第二方面所述的嵌合抗原受体或如第三方面所述的分离的多核苷酸或如第四方面的构建体或如第五方面所述的细胞在制备用于检测dll3的产品或与dll3结合的产品或用于诊断或防治表达dll3的肿瘤的产品。

46、本技术的第七方面提供一种检测产品，所述检测产品包含如第一方面所述的纳米抗体或如第二方面所述的嵌合抗原受体或如第三方面所述的分离的多核苷酸或如第四方面的构建体或如第五方面所述的细胞。

47、在某些实施方式中，所述检测产品用于检测dll3或与dll3结合。

48、本技术的第八方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的纳米抗体或如第二方面所述的嵌合抗原受体或如第三方面所述的分离的多核苷酸或如第四方面的构建体或如第五方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

49、在某些实施方式中，所述药物组合物用于诊断或防治与表达dll3相关的肿瘤疾病。

50、与现有技术相比，本技术的有益效果为：

51、（1）本技术以dll3重组蛋白免疫未经免疫的羊驼，构建噬菌体展示纳米抗体库，根据该噬菌体展示纳米抗体库对抗dll3抗体进行筛选，所得纳米抗体可特异性的结合dll3抗原，且亲和力较好，通过抗体半数有效浓度（ec50）的测定可知，ec50分别为15.14ng/ml、15.72ng/ml、11.49ng/ml、8.25ng/ml、14.53ng/ml、10.81ng/ml、11.36ng/ml、11.10ng/ml、6.87ng/ml和8.49ng/ml。

52、（2）本技术提供的抗dll3的纳米抗体具有较好的亲和力，将其作为抗原结合结构域构建嵌合抗原受体，并利用该嵌合抗原受体制备t细胞，所述car-t细胞对dll3阳性的肿瘤细胞具有杀伤活性，且与dll3阳性细胞共培养后，高效分泌细胞因子ifn-γ，说明本技术的抗dll3的纳米抗体能够有效应用于免疫治疗，对于开发肿瘤治疗药物具有重要意义。