以一碳化合物为原料合成L-苏氨酸的工程菌株及应用的制作方法

本发明为合成生物学，具体而言，涉及以一碳化合物为原料合成l-苏氨酸的工程菌株及应用。

背景技术：

1、随着全球对可持续、绿色化工原料需求的不断增加，必需氨基酸 l-苏氨酸 (l-threonine) 的市场需求持续增长。l-苏氨酸作为一种结构简单、功能多样的β-羟基-α-氨基酸，被广泛用于食品强化剂、饲料添加剂、医药、营养补充剂等领域。

2、传统工业上，l-苏氨酸主要通过微生物发酵法生产：以葡萄糖等多碳碳源为原料，通过糖酵解、三羧酸循环及磷酸戊糖途径提供前体，并依次经过天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、苏氨酸合酶等五步酶促反应生成苏氨酸。

3、然而，依赖葡萄糖等粮食来源作为碳源的发酵路线存在显著局限性：其生产成本受粮食价格波动影响较大，且与粮食供应存在争夺资源的社会争议。鉴于此，开发基于廉价、一碳 (c1) 原料 (如甲醇、甲醛、二氧化碳) 的l-苏氨酸合成新路线，具有重要的经济价值与社会意义。

4、一碳原料例如甲醇、甲醛、co2相比多碳糖类具有多方面潜在优势：首先，这些 c1物质资源丰富、制造成本低，且不与粮食供应系统直接竞争；其次，从 c1 化合物出发合成生物产品，可借助其较高的还原当量，理论上为还原性氨基酸 (如l-苏氨酸) 的生物合成提供更充足的还原力，从而可能提高碳转化效率和产品收率。甲醇氧化形成的是 nadh，而氨基酸合成更多依赖 nadph：

5、在工程菌（如 e. coli）中表达 nadh 激酶，可以将 nadh 转换为 nadph来满足苏氨酸合成对 nadph 的需求，同时释放 nad⁺供甲醇脱氢循环继续工作。

6、因此，鉴于传统葡萄糖发酵法生产苏氨酸面临资源竞争、成本波动与可持续性挑战，而 c1 原料作为低成本、易获取、与粮食体系无直接冲突的碳源，其较高还原性和潜在的生物转化效率，使得开发基于 c1 原料合成苏氨酸的新路线具有显著意义和应用前景。为此，有必要探索并建立一种以 c1 化合物 (如甲醇、甲醛、co2等) 为原料，结合代谢工程技术，实现高效、低成本、可持续的大规模l-苏氨酸生产路线。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何实现以一碳化合物为原料合成l-苏氨酸。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种重组菌，所述重组菌能以甲醇为原料合成l-苏氨酸。上述重组菌进行如下（1）-（8）项改造中的至少一种而获得的：

4、（1） 增强天冬氨酸转氨酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

5、（2） 增强天冬氨酸激酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

6、（3） 增强天冬氨酸半醛脱氢酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

7、（4） 增强高丝氨酸脱氢酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

8、（5） 增强高丝氨酸激酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

9、（6） 增强苏氨酸合成酶的基因表达量，和/或增强其酶活性或含量；

10、（7） 导入苏氨酸外排蛋白基因，和/或导入具有该蛋白活性的物质；

11、（8） 导入nadh激酶基因，和/或导入具有该酶活性的物质。

12、进一步地，所述出发菌株为具有甲醇耐受特性的菌株。

13、进一步地，所述具有甲醇耐受特性的菌株可为重组大肠杆菌。更进一步地，所述重组大肠杆菌可为通过人工改造而已经具有甲醇利用代谢途径的大肠杆菌菌株。在本发明的一些具体实施例中，所述重组大肠杆菌为大肠杆菌gl05菌株（保藏编号：cgmcc no.35139）。

14、上述（1）、（7）的改造具体可为：将天冬氨酸转氨酶基因（aspc）、l-苏氨酸外排转运蛋白基因（rhtc）的启动子替换为p119启动子。

15、上述（2）-（6）的改造具体可为：将编码天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶基因（thra）、高丝氨酸激酶基因（thrb）、苏氨酸合成酶基因（thrc）、天冬氨酸半醛脱氢酶基因（tmasd）的表达框以质粒形式导入宿主细胞。

16、上述（8）的改造具体可为：将编码肉豆蔻酰基转移酶的基因（lpxm）敲除，并替换为nadh 激酶基因（pos5）的表达框。

17、进一步地，所述天冬氨酸半醛脱氢酶（tmasd）来源于运动替斯崔纳菌（tistrellamobilis）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）。

18、其中，所述p119启动子的核苷酸序列是seq id no.3；所述天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶（thra）的的ncbi参考序列号为np_414543.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 945803（2025.12.09）；所述天冬氨酸转氨酶（aspc）的ncbi参考序列号为np_415448.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 945553（2025.12.09）；所述高丝氨酸激酶（thrb）的ncbi 参考序列号为np_414544.1，其编码基因的ncbi 参考序列号为 geneid: 947498（2025.12.09）；所述苏氨酸合成酶（thrc）的ncbi参考序列号为np_414545.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 945198（2025.12.09）；所述l-苏氨酸外排转运蛋白（rhtc）的ncbi参考序列号为yp_026264.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id:948317（2025.12.09）；所述天冬氨酸半醛脱氢酶（tmasd）来源于运动替斯崔纳菌（tistrella mobilis），其ncbi参考序列号为afk54850.1，其编码基因的ncbi参考序列号为cp003236.1:3330149..3331141，（2014.1.31）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），其ncbi参考序列号为np_015136.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 855913（2026.1.24）。

19、进一步地，所述具有甲醇耐受特性的菌株还可为芽孢杆菌。更进一步地，所述芽孢杆菌可为甲醇芽孢杆菌（bacillus methanolicus）。也可为其他天然存在或通过人工改造而已经具有甲醇利用代谢反应的芽孢杆菌菌株。在本发明的一些具体实施例中，所述芽孢杆菌为芽孢杆菌yw01菌株（保藏编号：cgmcc no. 37312）。

20、上述（1）、（7）的改造具体可为：将编码天冬氨酸转氨酶基因（aspb）、l-苏氨酸外排转运蛋白基因（rhtc）的表达框整合到编码丙酮酸甲酸裂解酶的基因pflb位点。

21、上述（2）、（4）的改造具体可为：将编码乙酰辅酶合成酶1的基因（acsa1）敲除，并替换为天冬氨酸激酶基因（dapg）和高丝氨酸脱氢酶基因（hom1）的表达框。

22、上述（3）、（8）的改造具体可为：将编码乙酰辅酶合成酶2的基因（acsa2）敲除，并替换为天冬氨酸半醛脱氢酶基因（basd）和nadh 激酶基因（pos5）的表达框。

23、上述（5）、（6）的改造具体可为：高丝氨酸激酶（bthrb）、苏氨酸合成酶基因（bthrc）的表达框以质粒形式导入生物细胞。

24、进一步地，所述l-苏氨酸外排转运蛋白基因（rhtc）来源于大肠杆菌（escherichiacoli）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）。

25、其中，所述天冬氨酸转氨酶（aspb）的氨基酸序列如seq id no.23，编码基因序列如seq id no.14；所述天冬氨酸激酶（dapg）的氨基酸序列如seq id no.24，编码基因序列如seq id no.15；所述天冬氨酸半醛脱氢酶（basd）的氨基酸序列如seq id no.25，编码基因序列如seq id no.16；所述高丝氨酸脱氢酶（bhom1）的氨基酸序列如seq id no.26，编码基因序列如seq id no.17；所述高丝氨酸激酶（bthrb）的氨基酸序列如seq id no.27，编码基因序列如seq id no.18；所述苏氨酸合成酶（bthrc）的氨基酸序列如seq id no.28，编码基因序列如seq id no.19；所述l-苏氨酸外排转运蛋白（rhtc）的ncbi参考序列号为yp_026264.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 948317（2025.12.09）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），其ncbi参考序列号为np_015136.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 855913（2026.1.24）。

26、进一步地，所述具有甲醇耐受特性的菌株还可为酵母。更进一步地，所述酵母可为巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris，分类名称为法夫驹形氏酵母，komagataella phaffii）或多形汉逊酵母（hansenula polymorpha，分类名称为拟多形假丝酵母，ogataeaparapolymorpha）。也可为其他天然存在或通过人工改造而已经具有甲醇利用代谢反应的酵母菌株。在本发明的一些具体实施例中，所述作为受体菌的酵母为多形汉逊酵母ap17菌株（保藏编号：cgmcc no. 39154）。

27、上述（1）的改造具体可为：在整合位点cis1插入天冬氨酸转氨酶基因（ast）的表达框；

28、上述（2）-（3）的改造具体可为：在整合位点cis2插入天冬氨酸激酶基因（opak）、天冬氨酸半醛脱氢酶基因（opasd）的表达框；

29、上述（4）-（5）的改造具体可为：在整合位点cis3插入高丝氨酸脱氢酶基因（ophdh）、高丝氨酸激酶基因（ophk）的表达框；

30、上述（6）-（7）的改造具体可为：在整合位点cis4插入苏氨酸合成酶基因（opts）、l-苏氨酸外排转运蛋白基因（rhtc）、苏氨酸合成酶基因（opts）的表达框；

31、上述（8）的改造具体可为：在整合位点cis5插入nadh 激酶基因（pos5）的表达框；

32、进一步地，所述l-苏氨酸外排转运蛋白基因（rhtc）来源于大肠杆菌（escherichiacoli）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）。

33、其中，所述天冬氨酸转氨酶（ast）的ncbi参考序列号为xp_013933818.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 25771275（2025.07.09）；所述天冬氨酸激酶（opak）的的ncbi参考序列号为xp_013934162.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 25773342（2025.07.09）；所述天冬氨酸半醛脱氢酶（opasd）的ncbi 参考序列号为xp_013936424.1，其编码基因的ncbi 参考序列号为 gene id: 25774038（2025.07.09）；所述高丝氨酸脱氢酶（ophdh）的ncbi参考序列号为xp_013932360.1，其编码基因的ncbi参考序列号为geneid: 25772026（2025.07.09）；所述高丝氨酸激酶（ophk）的ncbi参考序列号为xp_013932987.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 25772620（2025.07.09）；所述苏氨酸合成酶（opts）的ncbi参考序列号为 xp_013932758.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 25772401（2025.07.09）；所述l-苏氨酸外排转运蛋白（rhtc）的ncbi参考序列号为yp_026264.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 948317（2025.12.09）；所述nadh 激酶（pos5）来源于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），其ncbi参考序列号为np_015136.1，其编码基因的ncbi参考序列号为gene id: 855913（2026.1.24）。

34、第二方面，本发明提供了一种重组菌，所述重组是在第一方面所述重组菌的基础上，进一步进行了如下（9）-（11）项改造中的至少一种而获得的：

35、（9） 导入3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp），和/或导入具有该酶活性的物质；

36、（10） 导入羟基丙酮酸脱氢酶（hpda）基因，和/或导入具有该酶活性的物质；

37、（11） 导入5-磷酸木酮糖合成酶（xps）基因，和/或导入具有该酶活性的物质。

38、在本发明的以大肠杆菌gl05菌株为出发菌株的具体实施例中，上述（9）-（11）的改造具体可为：将编码乙酸激酶（acka）基因敲除，并替换为3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）、羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）和5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的表达框。

39、其中，所述3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）的氨基酸序列如seq id no.29，编码基因序列如seq id no.20；所述羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）的氨基酸序列如seq idno.30，编码基因序列如seq id no.21；所述5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的氨基酸序列如seq id no.31，编码基因序列如seq id no.22。

40、在本发明的以芽孢杆菌yw01菌株为出发菌株的具体实施例中，上述（9）-（11）的改造具体可为：在以芽孢杆菌yw01菌株为出发菌株的改造中，进一步将编码乙酰辅酶合成酶3的基因（acsa3）敲除，并替换为3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）、羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）和5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的表达框。

41、其中，所述3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）的氨基酸序列如seq id no.29，编码基因序列如seq id no.20；所述羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）的氨基酸序列如seq idno.30，编码基因序列如seq id no.21；所述5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的氨基酸序列如seq id no.31，编码基因序列如seq id no.22。

42、在本发明的以多形汉逊酵母ap17菌株为出发菌株的具体实施例中，上述（9）-（11）的改造具体可为：在以多形汉逊酵母ap17菌株为出发菌株的改造中，进一步在整合位点cis8插入3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）、羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）和5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的表达框。

43、其中，所述3-磷酸甘油酸磷酸酶基因（pgp）的氨基酸序列如seq id no.29，编码基因序列如seq id no.32；所述羟基丙酮酸脱氢酶基因（hpda）的氨基酸序列如seq idno.30，编码基因序列如seq id no.33；所述5-磷酸木酮糖合成酶基因（xps）的氨基酸序列如seq id no.31，编码基因序列如seq id no.34。

44、第三方面，本发明提供了一种构建重组菌的方法，所述重组菌能够提高l-苏氨酸产量，该方法包括按照第一方面所述的改造（1）-（8）对出发菌株进行改造的步骤。

45、第四方面，本发明提供了一种构建重组菌的方法，所述重组菌能够提高l-苏氨酸产量，该方法包括按照第一方面所述的改造（1）-（8）对出发菌株进行改造的步骤，以及按照第二方面所述的改造（9）–（11）进行改造的步骤。

46、第五方面，本发明提供了第一至第四方面任一项所述的重组菌在生产或提高l-苏氨酸产量中的应用。

47、第六方面，本发明提供了一种生产或提高l-苏氨酸产量的方法，包括如下步骤：以甲醇或甲醛为原料，培养第一至四方面任一项所述的重组菌，收集培养物，得到l-苏氨酸。

48、本发明中，所述甲醇原料可来源于二氧化碳及含二氧化碳的气体。具体地，可通过电解水产生氢气，再以氢气和二氧化碳为原料通过化学反应合成甲醇。

49、上述产品可为含有所述重组菌的菌剂或/和所述重组菌的培养物。

50、术语“培养物”是指经人工接种和培养后，长有微生物群体的液体或固体产物（即发酵产物）的统称。即通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分。

51、本发明取得的有益技术效果如下：

52、本发明提供了可利用甲醇、甲醛等原料高效合成l-苏氨酸的重组菌，建立了以二氧化碳、甲醇、甲醛等为原料合成l-苏氨酸的路线，具有极大的经济价值和社会价值。

53、保藏说明

54、（1）菌种名称：拟多形假丝酵母

55、拉丁名： ogataea parapolymorpha

56、菌株编号：ap17

57、保藏机构：cgmcc-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

58、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

59、保藏日期：2026年3月11日

60、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.39154

61、（2）菌种名称：大肠埃希氏菌

62、拉丁名： escherichia coli

63、菌株编号：gl05

64、保藏机构：cgmcc-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

65、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

66、保藏日期：2025年7月8日

67、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.35139

68、（3）菌种名称：芽孢杆菌

69、拉丁名： bacillus sp.

70、菌株编号：yw01

71、保藏机构：cgmcc-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

72、地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

73、保藏日期：2026年1月7日

74、保藏中心登记入册编号：cgmcc no.37312