产白头翁皂苷B4的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

本发明属于生物，尤其涉及产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、毛茛科白头翁属多年生草本植物白头翁（

pulsatilla chinensis （bunge）regel）的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢的功效。其主要有效成分为白头翁皂苷b4（anemosideb4，ab4）和白头翁皂苷b5（常春藤皂苷c，hederacoside c），现代药理研究表明ab4具有显著的抗炎、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等多种药理活性。

2、目前ab4的原料获取完全依赖多年生白头翁药材地下部分提取获得，导致地上部分资源浪费，同时严重依赖土地资源和生长周期。更严重的是，除白头翁外，基源混杂问题和伪品掺杂严重，导致ab4产量供给不稳定，进而使原料生产成本增加。利用合成生物学方法，构建高效合成白头翁皂苷b4的细胞工厂，实现其稳定供应，是满足临床需求和现实白头翁资源可持续利用的基础。

3、然而迄今为止，尚未见到生产白头翁皂苷b4的微生物菌株的相关报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的是现有技术中缺少生产白头翁皂苷b4的微生物菌株的技术问题，本发明的目的在于提供产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，基于模块化合成生物学策略在酿酒酵母中重构白头翁皂苷b4的合成途径，实现了以环保无污染的方式合成复杂的五环三萜皂苷类抗炎活性化合物白头翁皂苷b4。

2、本发明的第一个目的是提供产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌。

3、为达到第一个目的，本发明采用以下技术方案：

4、产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌，其以酿酒酵母为出发菌株进行基因改造，具有如下特征1）～5）：

5、1）表达一个或多个拷贝的酿酒酵母密码子优化过的外源基因：油橄榄（

olea

europaea）中羽扇豆醇环化酶的编码基因oeoew、迷迭香（

rosmarinus officinalis）中羽扇豆醇c-28位细胞色素p450单加氧酶的编码基因rocyp01、拟南芥（

arabidopsis thaliana）中细胞色素p450还原酶的编码基因atr1与atr2。

6、2）表达一个或多个拷贝的基因，并敲除调控因子。

7、拷贝的基因包括酵母内源基因、酿酒酵母密码子优化过的外源基因中的任意一种或两种。

8、酵母内源基因包括：乙酰乙酰辅酶a硫解酶编码基因scerg10、hmg-coa合酶编码基因scerg13、甲羟戊酸激酶编码基因scerg12、磷酸甲羟戊酸激酶编码基因scerg8、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶编码基因scerg19、异戊烯基焦磷酸异构酶编码基因scidi1、法尼基焦磷酸合酶编码基因scerg20、鲨烯合酶编码基因scerg9、鲨烯环氧酶编码基因scerg1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶的编码基因scthmg1和schmg2、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因sczwf1、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的编码基因scgnd1、非氧化阶段由转醛醇酶的编码基因sctal1、转酮醇酶的编码基因sctkl1、nadph激酶的编码基因scpos5、丙酮酸转运载体蛋白的编码基因scmpc1和scmpc3、柠檬酸转运蛋白的编码基因scyhm2、柠檬酸盐转运蛋白的编码基因scctp1、蛋白磷酸酶的编码基因scptc7中的任意一种或几种。

9、酿酒酵母密码子优化过的外源基因包括：圆红冬孢酵母（

rhodosporidium

toruloides）柠檬酸盐合成酶的编码基因rtcit1、构巢曲霉菌（

aspergillus nidulans）高效柠檬酸盐裂解酶的编码基因anacla和anaclb、油橄榄（

olea europaea）中羽扇豆醇环化酶的编码基因oeoew、迷迭香（

rosmarinus officinalis）中羽扇豆醇c-28位细胞色素p450单加氧酶的编码基因rocyp01中的任意一种或几种。

10、敲除的调控因子包括：酵母内源氧敏感转录调控因子scrox1。

11、3）表达一个或多个拷贝的酵母内源基因：磷酸葡萄糖糖化酶的编码基因scpgm1、udp-葡萄糖焦磷酸化酶编码基因scugp1，以及酿酒酵母密码子优化过的外源基因：拟南芥（

arabidopsis thaliana）中udp-葡萄糖脱氢酶1的编码基因atugd1、udp-葡萄糖醛酸脱羧酶3的编码基因atuxs3、udp-葡萄糖4-差向异构酶1的编码基因atuge1、udp-木糖4-差向异构酶的编码基因atuxe、udp-鼠李糖合酶2的编码基因atrhm2。

12、4）表达一个或多个拷贝的酿酒酵母密码子优化过的细胞色素p450单加氧酶外源基因：白头翁中羽扇豆烷型五环三萜c-23位羟基化酶编码的基因pccyp2。

13、5）表达一个或多个拷贝的酿酒酵母密码子优化过的糖基转移酶外源基因：白头翁中c-3位糖基转移酶的编码基因pcugt1、pcugt2，c-28位糖基转移酶的编码基因pcugt3、pcugt4、pcugt5。

14、以genbank基因号表示，oeoew为ab025343.1，rocyp01为qih97372.1，atr1为nm_118585.4，atr2为oao96828.1，scerg10为856079，scerg13为854913，scerg12为855248，scerg8为855260，scerg19为855779，scidi1为855986，scerg20为853272，scerg9为856597，scerg1为853086，scthmg1为854900，schmg2为851171，sczwf1为855480，scgnd1为856589，sctal1为851068，sctkl1为856188，scpos5为855913，scmpc1为852800，scmpc3为853158，scyhm2为855282，scctp1为852594，scptc7为856475，anacla为xm_654947.2，anaclb为xm_654948.2，scrox1为856178，scpgm1为853732，scugp1为853830，atugd1为oap14742.1，atuxs3为oao91769.1，atuge1为np_172738.1，atuxe为caa90941.1、atrhm2为oap13336.1。

15、所述pccyp2的核苷酸序列见seq id no：1。

16、所述rtcit1的核苷酸序列见seq id no：2。

17、所述pcugt1的核苷酸序列见seq id no：3。

18、所述pcugt2的核苷酸序列见seq id no：4。

19、所述pcugt3的核苷酸序列见seq id no：5。

20、所述pcugt4的核苷酸序列见seq id no：6。

21、所述pcugt5的核苷酸序列见seq id no：7。

22、优选的，所述出发菌株由酿酒酵母cen.pk113-11c表达cas9蛋白且敲除gal80基因后得到（其构建方法已经在公开号为cn 116333900 a的专利申请中公开过）。

23、优选的，特征1）、特征3）中每种基因的拷贝数为1个。

24、优选的，特征2）中每种基因的拷贝数为1~2个。

25、更优选的，特征2）包括：表达1个拷贝的scerg10、scerg13、scerg12、scerg8、scerg19、scidi1、scerg20、scerg9、scthmg1、sczwf1、scgnd1、sctal1、sctkl1、scpos5、scmpc1和scmpc3、scyhm2、scctp1、scptc7、rtcit1、anacla和anaclb，表达2个拷贝的scerg1、schmg2、oeoew、rocyp01，同时敲除调控因子scrox1。

26、更加优选的，特征2）包括：表达1个拷贝的scerg1、scerg9，表达1个拷贝的scerg20、scidi1，表达1个拷贝的scerg13、scerg8、scerg12、scerg19，表达2个拷贝的schmg2以及表达1个拷贝的scthmg1、scerg10，表达1个拷贝的oeoew、rocyp01，表达1个拷贝的柔性连接肽链-(gggs)3-连接的oeoew和scerg1的融合表达基因，表达1个拷贝的rocyp01，表达1个拷贝的sczwf1、scgnd1、scpos5，表达1个拷贝的sctal1、sctkl1，表达1个拷贝的scmpc1、scmpc3、scyhm2，表达1个拷贝的rtcit1、scctp1，表达1个拷贝的柔性连接肽链-(gggs)3-连接的anacla和anaclb的融合表达基因，表达1个拷贝的scptc7。

27、优选的，特征4）中每种基因的拷贝数为1~4个，特征5）中每种基因的拷贝数为2个。

28、更优选的，特征4）中每种基因的拷贝数为4个。

29、本发明的第二个目的是提供产白桦脂酸、产糖供体、产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌。

30、为达到第二个目的，本发明采用以下技术方案：

31、产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌，与酿酒酵母出发菌株相比，其具有上述特征1）、特征2）。

32、产糖供体的酿酒酵母工程菌，与酿酒酵母出发菌株相比，其具有上述特征1）~特征3）。

33、产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌，与酿酒酵母出发菌株相比，其具有上述特征1）~特征4）。

34、本发明的第三个目的是提供参与白头翁皂苷b4生物合成的细胞色素p450单加氧酶。

35、为达到第三个目的，本发明采用以下技术方案：

36、参与白头翁皂苷b4生物合成的细胞色素p450单加氧酶，由外源基因pccyp2组成。

37、细胞色素p450单加氧酶外源基因pccyp2能够以白桦脂酸为底物合成23-羟基白桦脂酸。

38、本发明的第四个目的是提供产白桦脂酸、产糖供体、产23-羟基白桦脂酸或者产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌的构建方法。

39、为达到第四个目的，本发明采用以下技术方案：

40、产白桦脂酸、产糖供体、产23-羟基白桦脂酸或者产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块、cyp模块以及ugt模块中的至少两种。

41、所述白桦脂酸骨架合成模块包括在酿酒酵母出发菌株上表达特征1）中的基因，构建白桦脂酸初级细胞工厂；所述途径优化模块包括在白桦脂酸初级细胞工厂上表达特征2）中的基因，并敲除特征2）中的调控因子，构建产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌；所述糖供体合成模块包括在产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌上表达特征3）中的基因，构建产糖供体的酿酒酵母工程菌；所述cyp模块包括在产糖供体的酿酒酵母工程菌上表达特征4）中的基因，构建产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌；所述ugt模块包括在产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌上表达特征5）中的基因，构建产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌。

42、优选的，产白桦脂酸、产糖供体、产23-羟基白桦脂酸或者产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌的构建方法，具体包括以下步骤中的至少两种：

43、（1）整合白桦脂酸骨架合成模块：在酿酒酵母出发菌株上表达特征1）中的基因，构建白桦脂酸初级细胞工厂；

44、（2）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块：在步骤（1）得到的白桦脂酸初级细胞工厂上表达特征2）中的基因，构建产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌；

45、（3）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块：在步骤（2）得到的产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌上特征3）中的基因，构建产糖供体的酿酒酵母工程菌；

46、（4）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块、cyp模块：在步骤（3）得到的产糖供体的酿酒酵母工程菌上表达特征4）中的基因，构建产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌；

47、（5）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块、cyp模块以及ugt模块：在步骤（4）得到的产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌上表达特征5）中的基因，构建产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌。

48、更优选的，产白桦脂酸、产糖供体、产23-羟基白桦脂酸或者产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括以下步骤中的至少两种：

49、（1）整合白桦脂酸骨架合成模块：在酿酒酵母出发菌株上表达1个拷贝的atr1、atr2、oeoew、rocyp01，构建白桦脂酸初级细胞工厂hx2；

50、（2）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块：在步骤（1）得到的白桦脂酸初级细胞工厂hx2上表达1个拷贝的scerg10、scerg13、scerg12、scerg8、scerg19、scidi1、scerg20、scerg9、scthmg1、sczwf1、scgnd1、sctal1、sctkl1、scpos5、scmpc1和scmpc3、scyhm2、scctp1、scptc7、rtcit1、anacla和anaclb，表达2个拷贝的scerg1、schmg2、oeoew、rocyp01，同时敲除调控因子scrox1，构建产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌hx113；

51、（3）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块：在步骤（2）得到的产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌hx113上，表达1个拷贝的scpgm1和scugp1构建糖供体udp-glc（葡萄糖）的合成途径，表达1个拷贝的atudg1、atuxs3、atuge1和atuxe构建糖供体udp-ara（阿拉伯糖）的合成途径，表达1个拷贝的atrhm2构建糖供体udp-rha（鼠李糖）的合成途径，构建产糖供体的酿酒酵母工程菌hx131；

52、（4）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块、cyp模块：在步骤（3）得到的产糖供体的酿酒酵母工程菌hx131上表达4个拷贝的pccyp2，构建产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌hx138b；

53、（5）整合白桦脂酸骨架合成模块、途径优化模块、糖供体合成模块、cyp模块以及ugt模块：在步骤（4）得到的产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌hx138b上表达2个拷贝的糖基转移酶pcugt1、pcugt2、pcugt3、pcugt4、pcugt5（能够以23-羟基白桦脂酸为底物合成白头翁皂苷b4），构建产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌hx157a。

54、优选的，步骤（1）中，atr1、atr2同时整合的位点为i2；oeoew、rocyp01的整合位点为x2。

55、优选的，步骤（2）中，scerg1、scerg9同时整合的位点为xi3；

56、scerg20、scidi1同时整合的位点为xii1；

57、scerg13、scerg8、scerg12、scerg19同时整合的位点为xi1；

58、schmg2、scthmg1、scerg10同时整合的位点为iii2；

59、oeoew、rocyp01同时整合的位点为iii1；

60、将oeoew、scerg1通过连续三组蛋白融合的柔性连接肽链氨基酸序列gggs 连接得到oeoew-(gggs)3-scerg1，oeoew-(gggs)3-scerg1整合的位点为v3；

61、rocyp01整合的位点为xi2；

62、sczwf1、scgnd1、scpos5同时整合的位点为xii2；

63、sctal1、sctkl1同时整合的位点为ix2；

64、scmpc3、scmpc1、scyhm2同时整合的位点为xv3；

65、scctp1 、rtcit1同时整合的位点为x3；

66、将anaclb、anacla通过连续三组蛋白融合的柔性连接肽链氨基酸序列gggs 连接得到anaclb-(gggs)3-anacla，anaclb-(gggs)3-anacla整合的位点为iv5；

67、scptc7整合的位点为vii-4。

68、优选的，步骤（3）中，scpgm1、scugp1、atrhm2同时整合的位点为ii1；

69、atugd1、atuxe、atuge1、atuxs3同时整合的位点为xii5。

70、优选的，步骤（4）中，pccyp2整合的位点为xii3、ix1。

71、优选的，步骤（5）中，pcugt1整合的位点为xii4；

72、pcugt2整合的位点为vi1；

73、pcugt3整合的位点为xi7；

74、pcugt4整合的位点为vi3；

75、pcugt5整合的位点为xi8。

76、本发明的第五个目的是提供产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌在生产白头翁皂苷b4中的应用。

77、本发明的第六个目的是提供产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌在生产白桦脂酸中的应用。

78、本发明的第七个目的是提供产糖供体的酿酒酵母工程菌在生产糖供体udp-glc（葡萄糖）、udp-ara（阿拉伯糖）、udp-rha（鼠李糖）中的应用。

79、本发明的第八个目的是提供产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌在生产23-羟基白桦脂酸中的应用。

80、本发明的第九目的是提供白桦脂酸、23-羟基白桦脂酸、糖供体或者白头翁皂苷b4的生产方法，包括如下步骤中的至少一种：

81、a、在以10~20 g/l葡萄糖为碳源的培养基中，接种所述的产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌，进行发酵，提取发酵产物即得白桦脂酸。

82、b、在以10~20 g/l葡萄糖为碳源的培养基中，接种所述的产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌，进行发酵，提取发酵产物即得23-羟基白桦脂酸。

83、c、在以10~20 g/l葡萄糖为碳源的培养基中，接种所述的产糖供体的酿酒酵母工程菌，进行发酵，提取发酵产物即得糖供体udp-glc、udp-ara、udp-rha。

84、d、在以10~20 g/l葡萄糖为碳源的培养基中，接种所述的产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌，进行发酵，提取发酵产物即得白头翁皂苷b4。

85、优选的，步骤a、步骤b、步骤c、步骤d中，产白桦脂酸的酿酒酵母工程菌、产23-羟基白桦脂酸的酿酒酵母工程菌、产糖供体的酿酒酵母工程菌、产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌的初始接种od600为0.05~0.5。

86、优选的，步骤a、步骤b、步骤c、步骤d中，发酵条件包括：温度28~30℃，转速220~280rpm，时间为72~120 h，装液量(15~20) ml /100 ml锥形瓶。

87、优选的，步骤a、步骤b、步骤c、步骤d中，提取发酵产物的方法包括：采用甲醇、乙醇、乙腈、水中的任意一种或任意比例的几种混合液提取。

88、本发明的技术效果：

89、1、本发明利用微生物合成白头翁皂苷b4，与传统植物提取和化学合成相比，不受地理气候等条件限制，突破了复杂天然产物异源超长途径合成时途径未知与修饰效率低的技术难题，实现了白头翁皂苷b4的从头异源全合成。本发明构建的产白头翁皂苷b4的酿酒酵母工程菌，能高效、稳定生产抗炎活性成分白头翁皂苷b4，为后续白头翁皂苷b4的大规模生物合成提供了强有力的研究和应用基础。

90、2、本发明提供了用于白头翁皂苷生物合成的细胞色素p450单加氧酶pccyp2，能够以白桦脂酸为底物合成23-羟基白桦脂酸；本发明的糖基转移酶pcugt1、pcugt2、pcugt3、pcugt4、pcugt5以23-羟基白桦脂酸为底物合成白头翁皂苷b4。本发明的细胞色素p450单加氧酶pccyp2和糖基转移酶为白头翁皂苷b4提供了高效的生物合成方法，并为白头翁皂苷及其衍生物的人工合成奠定了基础。

91、3、本发明同时还构建了产白桦脂酸、23-羟基白桦脂酸、糖供体的酿酒酵母工程菌，实现了白桦脂酸、23-羟基白桦脂酸、糖供体udp-glc、udp-ara、udp-rha的微生物合成。