一种枯草芽孢杆菌工程菌及其级联催化构建方法和应用

本申请涉及分子生物学等领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌工程菌及其级联催化构建方法和应用。

背景技术：

1、炎症性肠病(ibd)的流行严重影响着人类的健康，常常引起胃肠道(gi)衰弱症状，甚至导致癌症。虽然ibd的确切发病机制尚不清楚，但它与胃肠道上皮屏障的破坏和肠道微生物的生态失调有关。症状控制的常规治疗依赖于药物干预，如氨基水杨酸盐、抗生素、皮质类固醇和免疫抑制剂。然而，它们的局限性在于有效性低和严重的副作用，可能导致头痛、抽搐、神经系统疾病和肾毒性。因此，开发一种简单、安全、有效的ibd治疗策略，诱导有效的缓解并长期维持是一个具有挑战性的目标。

2、长期以来，饮食干预一直被认为是通过调节微生物群、紧密连接和粘膜层来控制ibd症状的一种可接受和可持续的方法。然而，传统的ibd饮食疗法是随机的，具体的触发食物在个体之间差异很大。将常规食物转化为更具特异性和活性的物质被认为是一种有希望的替代方法，它可以更精确和有效地治疗ibd。琼脂糖是一种广泛分布于可食用的红藻中的天然海洋多糖，如江蓠和石花菜。研究表明，琼脂糖的降解产物琼脂寡糖具有显著的抗炎、抗氧化和益生元活性。利用微生物在胃肠道将琼脂糖降解成活性寡糖用肠炎的治疗和预防将是一种方便有效的食疗模式。然而，实现这一目标的最大瓶颈是，由于肠道中缺乏相关微生物或功能酶，人体通常无法将常规食品转化为特定的活性物质。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种枯草芽孢杆菌工程菌及其级联催化构建方法和应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明对益生菌枯草芽孢杆菌进行工程化改造，使其可以成功展示降解琼脂糖的三个酶，以期完成琼脂糖的多酶级联催化，获得活性寡糖，并有效治疗肠道炎症。

3、本发明的技术解决方案如下：

4、本发明的第一方面提供一种枯草芽孢杆菌工程菌，所述枯草芽孢杆菌工程菌（

bacillus subtilis）为枯草芽孢杆菌工程菌bs2024e1e2e3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2024966，保藏日期为2024年5月16日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

5、本发明的第二方面提供一种琼胶酶，所述琼胶酶由所述枯草芽孢杆菌工程菌制备得到。

6、优选地，所述琼胶酶包括i类β-琼胶酶、ii类β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶。

7、本发明的第三方面提供一种编码所述琼胶酶的基因，所述琼胶酶包括i类β-琼胶酶、ii类β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶，编码i类β-琼胶酶的基因的核苷酸序列包括如seqid no.1所示的序列，编码ii类β-琼胶酶的基因的核苷酸序列包括如seq id no.2所示的序列，编码α-新琼二糖水解酶的基因的核苷酸序列包括如seq id no.3所示的序列。

8、本发明的第四方面提供一种重组载体，含有所述基因。

9、本发明的第五方面提供一种所述枯草芽孢杆菌工程菌的级联催化构建方法，所述级联催化构建方法包括：以枯草芽孢杆菌wtδepsδbsla为出发菌株，将所述重组载体转入至所述出发菌株中获得的。

10、本发明的第六方面提供一种工程化生物被膜，所述工程化生物被膜包括所述枯草芽孢杆菌工程菌及其分泌物。

11、本发明的第七方面提供一种用于活性寡糖和/或单糖制备的活体材料，所述活体材料包括所述枯草芽孢杆菌工程菌或所述工程化生物被膜。

12、本发明的第八方面提供一种活性寡糖和/或单糖，由所述枯草芽孢杆菌工程菌或所述种琼胶酶或所述工程化生物被膜或所述活体材料降解琼脂糖产生得到。

13、本发明的第九方面提供一种所述枯草芽孢杆菌工程菌或所述种琼胶酶或所述工程化生物被膜或所述活体材料或所述活性寡糖和/或单糖在制备肠道炎症治疗药物中的用途。

14、本发明至少具有以下有益效果之一：

15、本申请通过在枯草芽孢杆菌中整合琼脂糖降解产生活性寡糖和单糖元件，得到一种枯草芽孢杆菌工程菌（

bacillus subtilis）bs2024e1e2e3，该工程菌能够产生降解琼脂糖的三个酶，分别为i类β-琼胶酶、ii类β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶，并能够通过该工程菌或工程化生物被膜或产生的三个酶开发一种降解琼脂糖产生活性寡糖和单糖，经过实验发现，降解琼脂糖产生活性寡糖和单糖实现耐受胃肠道的复杂环境和治疗肠道炎症，因此，本发明能够提供实现耐受胃肠道的复杂环境和治疗肠道炎症的工程菌、工程化生物被膜和生物被膜活体材料，从而提供了一种操作简单、有效、持续的肠炎食疗方法。

1.一种枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌工程菌（bacillus subtilis）为枯草芽孢杆菌工程菌bs2024e1e2e3，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2024966，保藏日期为2024年5月16日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

2.一种琼胶酶，其特征在于，所述琼胶酶由权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌制备得到。

3.根据权利要求2所述琼胶酶，其特征在于，所述琼胶酶包括i类β-琼胶酶、ii类β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶。

4.编码权利要求2~3任一项所述琼胶酶的基因，其特征在于，所述琼胶酶包括i类β-琼胶酶、ii类β-琼胶酶和α-新琼二糖水解酶，编码i类β-琼胶酶的基因的核苷酸序列包括如seq id no.1所示的序列，编码ii类β-琼胶酶的基因的核苷酸序列包括如seq id no.2所示的序列，编码α-新琼二糖水解酶的基因的核苷酸序列包括如seq id no.3所示的序列。

5.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求4所述基因。

6.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌的级联催化构建方法，其特征在于，所述级联催化构建方法包括：以枯草芽孢杆菌wtδepsδbsla为出发菌株，将权利要求5所述重组载体转入至所述出发菌株中获得的。

7.一种工程化生物被膜，其特征在于，所述工程化生物被膜包括权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌及其分泌物。

8.一种用于活性寡糖和/或单糖制备的活体材料，其特征在于，所述活体材料包括权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌或权利要求7所述工程化生物被膜。

9.一种活性寡糖和/或单糖，其特征在于，由权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌或权利要求2所述种琼胶酶或权利要求7所述工程化生物被膜或权利要求8所述活体材料降解琼脂糖产生得到。

10.一种权利要求1所述枯草芽孢杆菌工程菌或权利要求2所述种琼胶酶或权利要求7所述工程化生物被膜或权利要求8所述活体材料或权利要求9所述活性寡糖和/或单糖在制备肠道炎症治疗药物中的用途。