EpCAM抗体

本发明涉及一种epcam单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule, epcam，cd326）是一种由tacstd1基因编码的跨膜糖蛋白，广泛表达于正常上皮细胞表面，参与细胞间黏附、增殖及信号转导。在恶性肿瘤中，epcam常呈现异常高表达，这一特性使其成为肿瘤诊断、预后评估及靶向治疗的重要生物标志物。

2、epcam由胞外结构域、单次跨膜区和胞内短尾构成。其过表达与肿瘤发生密切相关：一方面，epcam通过抑制e-钙黏蛋白破坏细胞极性，促进上皮-间质转化（emt），增强肿瘤侵袭性；另一方面，其胞内段可激活wnt/β-catenin等致癌信号通路，驱动细胞增殖。在乳腺癌、结直肠癌、肺癌等多种实体瘤中，epcam过表达与肿瘤分期、转移及不良预后显著相关。epcam作为上皮源性标志物，在病理学中用于鉴别肿瘤组织来源。

技术实现思路

1、本发明提供了一种能结合epcam的抗体，本发明能特异性结合epcam，可用于epcam靶点的诊断。

2、具体的，本发明包括以下几个方面：

3、本发明第一方面涉及抗epcam单克隆抗体，其重链可变区vh的cdr1-3区氨基酸序列依次如seq id nos：1-3所示（nos在本领域表示序列号的并列列举，即序列号为1/2/3），轻链可变区vl的cdr1、3区氨基酸序列依次如seq id nos：4-5所示, cdr2区氨基酸序列为yqm。任选地，所述vh氨基酸序列为seq id no：6，或vl的序列为seq id no：7。本发明含恒定区的方案包括：

4、一个实施方案中，所述抗epcam单克隆抗体的重链恒定区选自来源于小鼠的igg。

5、在本发明的一个具体实施方案中，所述抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分的重链恒定区来源于小鼠的igg1。

6、在本发明的一个实施方案中，所述抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区为来源于小鼠的κ或λ。

7、在本发明的一个具体实施方案中，所述抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分的轻链恒定区来源于小鼠的κ。

8、本发明还涉及核酸分子，其含有编码本发明第一方面任一项的抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分的序列。

9、在本发明的一个实施方案中，所述核酸分子含有序列vh和/或vl：

10、序列vh: caggtccaactggtccagtcagggcctgaggtgaagaagcctggggcttcagtgaaggtgtcctgcaaggcttctggctacactttcaccaattacggtatgaattgggtgaggcaggcaccgggccagggcctggaatggatgggctggattaacacctataccggcgaaccgacctatggcgaagattttaaaggccgctttgcgtttagcctggataccagcgcgagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtatttttgcgcgcgctttggcaactatgtggattattggggccagggcagcctggtgaccgtgagcagc

11、序列vl: gatattgtgatgacccagagcccgctgagcctgccggtgaccccgggcgaaccggcgagcattagctgccgcagcagcaaaaacctgctgcatagcaacggcattacctatctgtattggtatctgcagaaaccgggccagagcccgcagctgctgatttatcagatgagcaacctggcgagcggcgtgccggatcgctttagcagcagcggcagcggcaccgattttaccctgaaaattagccgcgtggaagcggaagatgtgggcgtgtattattgcgcgcagaacctggaaattccgcgcacctttggccagggcaccaaagtggaaattaaa。

12、本发明还涉及重组载体，其含有本发明上述任一项核酸分子。

13、在本发明中，所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述载体含有本发明任一项所述的核酸分子，所述载体可以通过例如将上述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。

14、在本发明中，所述表达载体例如为原核表达载体、真核表达载体、噬菌体载体或病毒载体。其中所述原核表达载体例如为pet载体、pgex载体，所述真核表达载体例如为pcdna3.1、pegfp-c1、ppic9k，所述噬菌体载体例如为λ噬菌体载体λgt、λgt-λb，所述病毒载体例如为逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。

15、本发明还涉及重组细胞，其含有本发明任一项的重组载体。

16、在本发明的一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为适合表达抗体的细胞，例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞，或者大肠杆菌等细菌，或者酵母等真菌。在本发明的具体实施方案中，所述哺乳动物细胞为cho细胞，例如为cho－k1细胞。

17、本发明还涉及组合物，其含有本发明任一项的抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分、本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的重组细胞。

18、本发明还涉及本发明任一项的抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方法，其包括使用本发明任一项的核酸分子、本发明任一项的重组载体、或者本发明任一项的重组细胞的步骤。

19、在本发明的一个实施方案中，其具体包括以下步骤：

20、1）将本发明任一项的核酸分子的核苷酸序列克隆入表达载体中，得到重组表达载体；

21、2）将重组表达载体转入宿主细胞，得到重组细胞；

22、3）将步骤2）获得的重组细胞在目标培养基中进行培养，获得能够表达抗体的细胞株；

23、4）逐步放大培养步骤3）获得的细胞株，收获培养上清；

24、5）将步骤4）获得的培养上清进行纯化获得本发明任一项的抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分。

25、在本发明的一个实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为适合表达抗体的细胞，例如为来源于人、鼠或猴的哺乳动物细胞。在本发明的具体实施方案中，所述哺乳动物细胞为cho细胞，例如为cho－k1细胞。

26、本发明还涉及本发明任一项的抗epcam单克隆抗体或其抗原结合部分用于特异性结合epcam蛋白，尤其是用于epcam蛋白的检测或诊断。

27、以下对本发明做进一步描述：

28、在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

29、在本发明中，术语“抗体”是指通常由两对相同的多肽链（每对具有一条“轻”（l）链和一条“重”（h）链）组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(cdr))，其间散布有较保守的称为构架区（fr）的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末端排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabat sequences of proteins of immunological interest(national institutes of health, bethesda, md. (1987 and 1991))，或chothia &lesk (1987) j. mol. biol. 196:901-917; chothia等人 (1989) nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，igg (例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。

30、在本发明中，术语抗体的“抗原结合部分”是指全长抗体的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如，pcsk9)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见，fundamental immunology, ch. 7 (paul, w., ed., 第2版，ravenpress, n.y. (1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链抗体（例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

31、在本发明中，术语“fd片段”意指由vh和ch1结构域组成的抗体片段; 术语“fv片段”意指由抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“dab片段”意指由vh结构域组成的抗体片段(ward 等人, nature 341:544-546 (1989))；术语“fab片段”意指由vl、vh、cl和ch1结构域组成的抗体片段；术语“f(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。

32、在一些情况下，抗体的抗原结合部分是单链抗体(例如, scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如, bird等人,science 242:423-426 (1988)和huston等人, proc. natl. acad. sci. usa 85:5879-5883 (1988))。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头(连接肽)由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(ggggs)4的接头，但也可使用其变体(holliger等人(1993)，proc.natl. acad. sci. usa 90: 6444-6448)。可用于本发明的其他接头由alfthan等人(1995)，protein eng. 8:725-731，choi等人(2001)，eur. j. immunol. 31: 94-106，hu等人(1996)，cancer res. 56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j. mol. biol. 293:41-56和roovers等人(2001)，cancer immunol.描述。

33、可使用本领域技术人员已知的常规技术（例如，重组dna技术或酶促或化学断裂法）从给定的抗体（例如单克隆抗体2e12）获得抗体的抗原结合部分（例如，上述抗体片段），并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。

34、在本发明中，所述抗原结合部分包括单链抗体（scfv）、嵌合抗体、双抗体、scfv-fc二价分子、dab和互补决定区（cdr）片段、fab片段、fd片段、fab'片段、fv和f（ab'）2片段。

35、在本发明中，所述λ轻链恒定区包括各种同种异型，如 λⅰ、λⅱ、λⅲ、λⅵ。在本发明的的实施方案中，所述λ轻链恒定区为λⅱ型。

36、本发明涉及的抗体核酸分子也可以利用传统的基因工程重组技术或化学合成方法获得。一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列包含了抗epcam抗体的重链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列也包括抗epcam抗体的轻链可变区或抗体分子的部分核酸序列。另一方面，本发明涉及的抗体核酸分子的序列还包括重链或轻链可变区的cdr序列。互补决定区（complementary determinant region，cdr）是与抗原表位结合的部位，本发明中的cdr序列通过imgt/v-quest (http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)进行确定。但是不同的划分方法得到的cdr序列稍有不同。

37、本发明涉及含有所述核酸分子的重组表达载体，也涉及转化了这些分子的宿主细胞。而且，本发明还涉及利用包含了所述核酸分子的宿主细胞在特定条件下培养并分离得到发明所述抗体的方法。

38、在本发明中，术语“载体”指的是，可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体（yac）、细菌人工染色体（bac）或p1来源的人工染色体（pac）；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如sv40）。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。

39、在本发明中，术语“宿主细胞”指的是导入载体的细胞，包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞的动物细胞。

40、本发明的抗体片段可以利用水解完整的抗体分子获得(参见morimoto et al.,j. biochem. biophys. methods 24:107-117 (1992) and brennan et al., science229:81 (1985))。另外，这些抗体片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inhudson, curr. opin. immunol. 11: 548-557 (1999); little et al., immunol.today, 21: 364-370 (2000))。比如，fab'片段可以直接从e. coli细胞中获得或化学藕联形成f(ab')2 片段(carter et al., bio/technology, 10:163-167 (1992))。再如，f(ab')2 片段可以用亮氨酸拉链gcn4 连接获得。另外，fv、fab或f(ab')2 片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备抗体片段的其它技术。

41、在本发明中，“特异性结合”指的是，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和产生该抗体的抗原间的反应。此处，结合第一种抗原的抗体对第二种抗原的结合亲和力是检测不到或很弱。在某些实施方式中，一个某抗原特异性抗体是指以亲和力（kd）≤10-5 m（如10-6 m、10-7 m、10-8 m、10-9 m、10-10 m等）结合该抗原，其中kd指解离率与结合率的比值（koff/kon），其可以采用本领域技术人员熟悉的方法进行测定。

42、在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见immunology-asynthesis (第2版, e.s. golub和d.r. gren, eds., sinauer associates,sunderland, mass. (1991)), 其通过引用合并入本文。