肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体、多肽C端酰胺化酶及其应用的制作方法

本发明涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体、多肽c端酰胺化酶及其应用。

背景技术：

1、多肽c端酰胺化是提升多肽稳定性与药效的常用修饰手段。已上市药物如替尔泊肽，艾塞那肽，利司那肽，玛仕度肽，普兰林肽，齐考诺肽，特利加压素，鲑鱼降钙素等都在c端进行了酰胺化，此外在研的单靶点glp 1r（胰高血糖素样肽-1受体）激动剂或多靶点glp1r共激动剂，胰淀素药物超过50%也都进行了c端酰胺化修饰，足见该修饰的重要性。多肽c端酰胺化酶（也称为肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶，peptidyl-glycine alpha-amidatingmonooxygenase, pam）主要由2个结构域组成，分别是肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶(peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase, phm)和肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶(peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase, pal)，通过两个结构域之间的协同作用将多肽c末端的gly催化形成末端的酰胺，在一些高等动物中两个结构域之间通过linker（联接子）连接形成单一蛋白，而在一些低等动物中会是2个结构域分别表达，甚至只存在phm结构域。但是这类酶普遍存在表达困难，活性低等问题。

2、目前多肽c端酰胺化修饰的技术主要包括：化学法，采用特定的树脂在spps法合成多肽后，直接切割生成c端酰胺；电化学氧化-水解法(malins et al., j. am. chem. soc.2021, 143, 11811-11819）；光催化半胱氨酸法（novo nordisk, nat. commun. 2024, 15,1-8）；光催化硒醚法（shen peng et al., angew. chem. int. ed. 2025, e202502233）。这些方法在工业化放大过程中普遍存在问题，比如spps需要用到大量有机试剂，产品有消旋风险，成本较高；另外两种化学方法则有工艺复杂，副反应显著等问题。而酶修饰策略，以c端含有额外甘氨酸的多肽为底物，利用肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶（pam）对多肽c端的甘氨酸进行氧化、裂解，从而特异性的在c端形成酰胺。具有高选择性，绿色等优势。尤其适合通过发酵法生产的无侧链保护多肽的酰胺化修饰，具备良好的工业化应用前景。

3、然而由于pam主要来源于动物，其表达主要在中国仓鼠卵巢细胞（chinesehamster ovary cells，cho）中进行，成本高昂，此外天然pam的活性普遍偏低，限制了其规模化应用。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体、多肽c端酰胺化酶及其应用，以解决现有技术中多肽c端酰胺化酶的活性较低问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体，上述肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体包括：（a）以野生型肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶为基础发生突变的蛋白，上述突变选自如下任意一个或多个位点的突变：d62、g64、e65、n67、p69、d71、e72、p74、p83、k144、l145、v152、t153、g154、m254、a256或y282，上述野生型肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶的氨基酸序列如seq id no：1所示；或（b）与（a）中限定的氨基酸序列具有70%以上同一性且具有肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶活性的蛋白质。

3、进一步地，上述突变选自如下任意一种或多种突变：d62g、d62a、d62v、d62l、d62i、d62p、d62m、d62e、g64a、g64v、g64l、g64i、g64p、g64m、e65g、e65a、e65v、e65l、e65i、e65p、e65m、e65d、n67g、n67a、n67v、n67l、n67i、n67p、n67m、n67s、n67c、n67t、n67q、p69g、p69a、p69v、p69l、p69i、p69m、d71g、d71a、d71v、d71l、d71i、d71p、d71m、d71e、e72g、e72a、e72v、e72l、e72i、e72p、e72m、e72d、p74g、p74a、p74v、p74l、p74i、p74m、p83g、p83a、p83v、p83l、p83i、p83m、p83s、p83c、p83t、p83n、p83q、k144r、k144h、k144f、k144y、k144w、k144g、k144a、k144v、k144l、k144i、k144p、k144m、l145a、l145v、l145i、l145p、l145m、l145f、l145y、l145w、v152g、v152a、v152l、v152i、v152p、v152m、t153c、t153n、t153q、g154v、g154l、g154i、g154p、g154m、m254g、m254a、m254v、m254l、m254i、m254p、a256v、a256l、a256i、a256p、a256m、y282a、y282v、y282l、y282i、y282p、y282m、y282f、y282w、y282s、y282c、y282t、y282n或y282q，其中，数字前字母代表原始氨基酸，数字后字母代表突变氨基酸。

4、进一步地，上述突变包括如下任意一种氨基酸突变：d62g、d62g+e65g、d62g+p69g、d62g+d71g、d62g+e72g、d62g+e65a、d62g+l145f、d62g+v152m、d62g+e65g+p69g、d62g+e65g+d71g、d62g+e65g+e72g、d62g+p69g+d71g、d62g+p69g+e72g、d62g+d71g+e72g、d62g+e65a+p69g、d62g+e65a+d71g、d62g+e65a+e72g、d62g+e65a+l145f、d62g+e65a+v152m、d62g+e65g+l145f、d62g+p69g+l145f、d62g+d71g+l145f、d62g+e72g+l145f、d62g+e65g+v152m、d62g+p69g+v152m、d62g+d71g+v152m、d62g+e72g+v152m、d62g+l145f+v152m、d62g+e65g+p69g+d71g、d62g+e65g+p69g+e72g、d62g+e65g+d71g+e72g、d62g+p69g+d71g+e72g、d62g+e65a+p69g+d71g、d62g+e65a+p69g+e72g、d62g+e65a+d71g+e72g、d62g+e65g+p69g+l145f、d62g+e65g+d71g+l145f、d62g+e65g+e72g+l145f、d62g+p69g+d71g+l145f、d62g+p69g+e72g+l145f、d62g+d71g+e72g+l145f、d62g+e65a+p69g+l145f、d62g+e65a+d71g+l145f、d62g+e65a+e72g+l145f、d62g+e65g+p69g+v152m、d62g+e65g+d71g+v152m、d62g+e65g+e72g+v152m、d62g+p69g+d71g+v152m、d62g+p69g+e72g+v152m、d62g+d71g+e72g+v152m、d62g+e65a+p69g+v152m、d62g+e65a+d71g+v152m、d62g+e65a+e72g+v152m、d62g+e65g+l145f+v152m、d62g+e65a+l145f+v152m、d62g+p69g+l145f+v152m、d62g+d71g+l145f+v152m、d62g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65g+p69g+d71g+e72g、d62g+e65a+p69g+d71g+e72g、d62g+e65g+p69g+d71g+l145f、d62g+e65g+p69g+e72g+l145f、d62g+e65g+d71g+e72g+l145f、d62g+p69g+d71g+e72g+l145f、d62g+e65a+p69g+d71g+l145f、d62g+e65a+p69g+e72g+l145f、d62g+e65a+d71g+e72g+l145f、d62g+e65g+p69g+d71g+v152m、d62g+e65g+p69g+e72g+v152m、d62g+e65g+d71g+e72g+v152m、d62g+p69g+d71g+e72g+v152m、d62g+e65a+p69g+d71g+v152m、d62g+e65a+p69g+e72g+v152m、d62g+e65a+d71g+e72g+v152m、d62g+e65g+p69g+l145f+v152m、d62g+e65g+d71g+l145f+v152m、d62g+e65g+e72g+l145f+v152m、d62g+p69g+d71g+l145f+v152m、d62g+p69g+e72g+l145f+v152m、d62g+d71g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65a+p69g+l145f+v152m、d62g+e65a+d71g+l145f+v152m、d62g+e65a+e72g+l145f+v152m、d62g+e65g+p69g+d71g+e72g+l145f、d62g+e65g+p69g+d71g+e72g+v152m、d62g+e65a+p69g+d71g+e72g+l145f、d62g+e65a+p69g+d71g+e72g+v152m、d62g+e65g+p69g+d71g+l145f+v152m、d62g+e65g+p69g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65g+d71g+e72g+l145f+v152m、d62g+p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65a+p69g+d71g+l145f+v152m、d62g+e65a+p69g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65a+d71g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65g+p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、d62g+e65a+p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、e65g+p69g、e65g+d71g、e65g+e72g、p69g+d71g、p69g+e72g、d71g+e72g、e65a+p69g、e65a+d71g、e65a+e72g、e65a+l145f、e65a+v152m、e65g+l145f、p69g+l145f、d71g+l145f、e72g+l145f、e65g+v152m、p69g+v152m、d71g+v152m、e72g+v152m、l145f+v152m、e65g+p69g+d71g、e65g+p69g+e72g、e65g+d71g+e72g、p69g+d71g+e72g、e65a+p69g+d71g、e65a+p69g+e72g、e65a+d71g+e72g、e65a+p69g+l145f、e65a+d71g+l145f、e65a+e72g+l145f、e65a+p69g+v152m、e65a+d71g+v152m、e65a+e72g+v152m、e65a+l145f+v152m、e65g+p69g+l145f、e65g+d71g+l145f、e65g+e72g+l145f、p69g+d71g+l145f、p69g+e72g+l145f、d71g+e72g+l145f、e65g+p69g+v152m、e65g+d71g+v152m、e65g+e72g+v152m、p69g+d71g+v152m、p69g+e72g+v152m、d71g+e72g+v152m、e65g+l145f+v152m、p69g+l145f+v152m、d71g+l145f+v152m、e72g+l145f+v152m、e65g+p69g+d71g+e72g、e65a+p69g+d71g+e72g、e65g+p69g+d71g+l145f、e65g+p69g+e72g+l145f、e65g+d71g+e72g+l145f、p69g+d71g+e72g+l145f、e65a+p69g+d71g+l145f、e65a+p69g+e72g+l145f、e65a+d71g+e72g+l145f、e65g+p69g+d71g+v152m、e65g+p69g+e72g+v152m、e65g+d71g+e72g+v152m、p69g+d71g+e72g+v152m、e65a+p69g+d71g+v152m、e65a+p69g+e72g+v152m、e65a+d71g+e72g+v152m、e65g+p69g+l145f+v152m、e65g+d71g+l145f+v152m、e65g+e72g+l145f+v152m、p69g+d71g+l145f+v152m、p69g+e72g+l145f+v152m、d71g+e72g+l145f+v152m、e65a+p69g+l145f+v152m、e65a+d71g+l145f+v152m、e65a+e72g+l145f+v152m、e65g+p69g+d71g+e72g+l145f、e65a+p69g+d71g+e72g+l145f、e65g+p69g+d71g+e72g+v152m、e65a+p69g+d71g+e72g+v152m、e65g+p69g+d71g+l145f+v152m、e65g+p69g+e72g+l145f+v152m、e65g+d71g+e72g+l145f+v152m、p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、e65a+p69g+d71g+l145f+v152m、e65a+p69g+e72g+l145f+v152m、e65a+d71g+e72g+l145f+v152m、e65g+p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、e65a+p69g+d71g+e72g+l145f+v152m、d62a、d62v、d62l、d62i、d62p、d62m、d62e、g64a、g64v、g64l、g64i、g64p、g64m、e65g、e65a、e65v、e65l、e65i、e65p、e65m、e65d、p69g、p69a、p69v、p69l、p69i、p69m、d71g、d71a、d71v、d71l、d71i、d71p、d71m、d71e、e72g、e72a、e72v、e72l、e72i、e72p、e72m、e72d、p74g、p74a、p74v、p74l、p74i、p74m、p83g、p83a、p83v、p83l、p83i、p83m、p83s、p83c、p83t、p83n、p83q、k144r、k144h、k144f、k144y、k144w、k144g、k144a、k144v、k144l、k144i、k144p、k144m、l145a、l145v、l145i、l145p、l145m、l145f、l145y、l145w、v152g、v152a、v152l、v152i、v152p、v152m、t153c、t153n、t153q、g154v、g154l、g154i、g154p、g154m、m254g、m254a、m254v、m254l、m254i、m254p、a256v、a256l、a256i、a256p、a256m、y282a、y282v、y282l、y282i、y282p、y282m、y282f、y282w、y282s、y282c、y282t、y282n或y282q。

5、为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种多肽c端酰胺化酶，上述多肽c端酰胺化酶包括：上述的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体，和肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶。

6、进一步地，上述肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶包括：（c）以seq id no：3所示的野生型肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶；或（d）与（c）中限定的氨基酸具有70%以上同一性且具有肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶活性的蛋白质。

7、为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种dna分子，上述dna分子编码上述的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体、或上述的多肽c端酰胺化酶。

8、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种重组质粒，上述重组质粒含有上述的dna分子。

9、进一步地，上述重组质粒包括ppic9k或pet-28a(+)。

10、为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，上述宿主细胞内含有上述的dna分子或上述的重组质粒。

11、进一步地，上述宿主细胞包括酵母或大肠杆菌。

12、为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种酰胺化多肽的制备方法，上述制备方法包括：利用上述的多肽c端酰胺化酶，对多肽进行酰胺化修饰，制备获得上述酰胺化多肽。

13、进一步地，上述多肽包括c末端为甘氨酸的多肽。

14、进一步地，上述c末端为甘氨酸的多肽包括胰淀素、利司那肽或艾塞那肽。

15、进一步地，上述多肽的c端到n端方向起第二位氨基酸为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

16、为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种上述的肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体、上述的多肽c端酰胺化酶、上述的dna分子、上述的重组质粒、上述的宿主细胞、或上述酰胺化多肽的制备方法在多肽的酰胺化修饰中的应用。

17、进一步地，上述多肽包括多肽药物；上述多肽药物包括艾塞那肽、利司那肽、齐考诺肽、特利加压素、鲑鱼降钙素或胰淀素。

18、应用本发明的技术方案，利用上述肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶突变体，其能够较好地与肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂解酶发挥协同作用，实现多肽c端酰胺化酶的催化活性，能够实现对多肽进行高效酰胺化修饰的技术效果，能够较好的制备获得酰胺化的多肽。上述多肽c端酰胺化酶相较于野生型酶，在多肽或药物的酰胺化修饰效率较高，高度契合现代制药工业对绿色、高效和安全生产的迫切需求。