一种恩诺沙星核酸适配体及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及食品安全检测与功能核酸设计领域，特别是涉及一种恩诺沙星核酸适配体及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、恩诺沙星（enrofloxacin，enr）为氟喹诺酮类抗菌药物，在畜禽和水产养殖领域具有较广泛的应用。针对动物源性食品及相关样品中的恩诺沙星残留，开发灵敏、快速且便于构建传感体系的识别元件具有重要意义。核酸适配体由特定寡核苷酸序列构成，可通过自身空间构象与靶标发生特异性结合，具有易于合成、易于修饰及稳定性较好等特点，可作为恩诺沙星检测体系的分子识别元件。

2、传统核酸适配体通常通过selex（systematic evolution of ligands byexponential enrichment）类筛选策略从随机核酸文库中获得。该类方法的核心在于多轮结合、分离与富集，筛选过程具有较强的实验依赖性和一定随机性。对于恩诺沙星等小分子靶标，仅依赖随机文库筛选往往难以充分利用已有高亲和力序列中已经形成的有效结合结构信息。

3、随着分子结构预测和分子对接技术的发展，可通过计算方法预测核酸适配体与小分子之间的结合构象并获得分子对接评分（affinity）。然而，若仅将分子对接作为候选序列的评分工具，而不进一步解析已知优良适配体中参与结合的具体核苷酸、活性片段、结合位置和相互作用类型，则新序列的产生仍可能依赖经验组合或随机变换，不能充分发挥已有高亲和力模板所包含的结构信息。

4、因此，有必要建立一种从“已知模板—结合信息解析—定向序列设计—批量虚拟筛选—实验验证—动态机制验证”逐级推进的核酸适配体设计筛选方法，以获取高亲和力恩诺沙星核酸适配体，克服突破传统selex筛选的随机性和经验依赖性。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种恩诺沙星核酸适配体及其筛选方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该方法通过对已知高亲和力适配体进行分子对接与相互作用解析，识别活性碱基及活性片段，进而实施多模板片段融合、非关键区域截短及关键碱基定向优化，结合二次虚拟筛选与实验验证，获得亲和力显著提升的适配体。该方法突破了传统selex筛选的随机性与经验依赖，实现了基于结构信息的理性设计，所获适配体可应用于比色-荧光双模式检测体系，为恩诺沙星残留检测提供高效识别元件。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种恩诺沙星核酸适配体，所述恩诺沙星核酸适配体的核苷酸序列如seq id no.9所示。

4、本发明还提供所述的恩诺沙星核酸适配体在制备恩诺沙星检测产品中的应用。

5、优选的是，所述检测产品包括比色检测试剂盒或荧光检测试剂盒。

6、本发明还提供一种恩诺沙星检测体系，包含所述的恩诺沙星核酸适配体以及金属有机框架材料。

7、优选的是，所述检测体系为比色-荧光双模式检测体系，其中，比色模式是利用所述金属有机框架材料催化显色体系进行显色；荧光模式是采用fam标记的恩诺沙星适配体，基于所述金属有机框架材料对邻近的fam标记产生荧光猝灭，恩诺沙星诱导所述恩诺沙星适配体构象改变，使得fam标记的恩诺沙星适配体释放实现荧光信号恢复。

8、本发明还提供一种所述的恩诺沙星核酸适配体的设计筛选方法，包括以下步骤：

9、获取多条已知恩诺沙星核酸适配体及其亲和力数据，选取亲和力满足预设条件的适配体作为模板；

10、对所述模板进行三级结构构建，并与恩诺沙星进行分子对接，根据分子对接的评分，获取评分最高的三级结构，即得最优结合构象；

11、对所述最优结合构象进行相互作用分析，标记直接参与恩诺沙星结合的核苷酸为活性碱基，并基于所述活性碱基及其相邻序列定义活性核苷酸片段；

12、基于所述活性核苷酸片段，对多条所述模板的活性区域进行跨模板组合，并对非关键区域进行截短，构建初始候选序列库；

13、对所述初始候选序列库中的序列进行关键碱基定向优化和重复性筛查，获得候选序列库；

14、对所述候选序列库中的序列重新进行三级结构构建，并再次与恩诺沙星进行分子对接，以分子对接评分为指标进行虚拟筛选，得到虚拟筛选后的候选序列；

15、对所述虚拟筛选后的候选序列进行实验亲和力验证，选取亲和力最高的序列作为目标恩诺沙星核酸适配体。

16、优选的是，所述亲和力满足预设条件的适配体为解离常数kd＜100 nm的适配体。

17、优选的是，所述模板包括主模板和副模板，所述主模板为seq.a52和apt58，所述副模板为seq.a5、apt6、seq11、seq.a6、seq10和seq13；

18、其中，所述seq.a52和apt58的核苷酸序列分别如seq id no.1和seq id no.2所示；所述seq.a5、apt6、seq11、seq.a6、seq10和seq13的核苷酸序列分别如seq id no.3、seqid no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7和seq id no.8所示。

19、优选的是，所述相互作用分析包括氢键数量、π-π疏水相互作用、π-烷基疏水相互作用以及卤键的作用距离和作用类型。

20、优选的是，所述关键碱基定向优化为：以所述活性碱基的位置、相互作用类型和作用距离为依据，对所述初始候选序列库中的序列进行关键碱基保留、定向替换及序列重构；

21、所述实验亲和力验证采用氧化石墨烯荧光淬灭法进行，通过非线性拟合计算解离常数kd。

22、本发明公开了以下技术效果：

23、（1）提供了一种高亲和力恩诺沙星核酸适配体en46：本发明通过理性设计筛选获得的en46适配体，其解离常数kd值达6.42±3.07 nm，低于现有报道的多数恩诺沙星适配体（如模板seq.a52的kd为11.07 nm），具有优异的靶标结合亲和力，为恩诺沙星检测提供了更灵敏的识别元件。

24、（2）由“对接评分排序”进一步提升为“模板结合信息反向解析”：本发明在对模板适配体进行分子对接后，不仅记录分子对接评分，还系统提取具体作用碱基、作用位置、作用距离、恩诺沙星官能团以及氢键、π相关疏水作用和卤键等信息，为后续序列设计提供明确的结构依据。

25、（3）建立多模板活性片段融合、截短及关键碱基定向优化方法：本发明不是通过随机突变产生候选序列，而是根据多个模板适配体与恩诺沙星分子对接所识别出的活性核苷酸、优势片段及关键作用力进行跨模板片段组合和截短优化。以en46为例，其以seq.a52、seq10和apt6为具体序列来源，通过活性片段融合、非关键区域截短以及优势碱基定向优化获得，使候选序列的产生具有明确的模板结构信息依据。

26、（4）可对较大候选序列库实施快速虚拟预筛选：本发明实施方式以8条模板的结构信息出发设计94条初始序列，经定向优化和去重后获得85条候选适配体，通过第二轮分子对接完成批量评价，再从中选择9条优势序列进行实验验证，从而将较大的候选序列库压缩为少量湿实验对象。

27、（5）计算结果获得实验验证：新设计序列在虚拟分子对接层面出现多条评分优于最佳模板的序列；最终优选en46的autodock vina分子对接评分为-9.375 kcal/mol，较模板seq.a52的-8.172 kcal/mol更有利。go荧光淬灭实验进一步表明en46的kd为6.42±3.07nm，低于采用同类型go荧光淬灭方法报道的seq.a52的11.07 nm，说明本发明的定向设计和逐级筛选策略能够获得具有较高实际亲和力的恩诺沙星核酸适配体。

28、（6）形成“静态结构设计—实验亲和力验证—动态机制验证”的闭环技术路线：进一步对en46-恩诺沙星复合体系进行100 ns分子动力学模拟，从rmsd、rmsf、rg、sasa、氢键和mm/pbsa结合自由能等角度评价其动态结合稳定性，为筛选结果提供机制层面的支持。本发明不仅获得具有高结合能力的恩诺沙星核酸适配体en46，而且利用ce/cu-bdc功能材料构建双模式验证体系，通过比色信号转换和荧光猝灭恢复机制证明en46具有良好的识别能力和应用价值。使本发明形成由计算设计、实验筛选、机制解析到应用验证的完整技术链。