一种抗菌药物的微生物限度检测方法与流程

本发明属于微生物检验，特别涉及一种抗菌药物的微生物限度检测方法。

背景技术：

1、非无菌产品微生物限度检查中的微生物计数法，是用于测定产品受微生物污染程度的关键质量控制手段，主要针对能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌（即需氧菌总数和霉菌、酵母菌总数）进行计数。《中华人民共和国药典》四部通则1105收载的“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”中，包括平皿法、薄膜过滤法、最可能数法（mpn法）。其中薄膜过滤法因易操作、风险低和准确度高等优点，应用更广泛。薄膜过滤法是将供试液通过滤膜，将微生物截留在膜上，然后将滤膜贴于培养基表面培养，培养过程中菌落生长在培养基内部。

2、抗菌药物的微生物限度检测中，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉这五种菌株是缺一不可的测试菌株，因此，五种菌株回收率全部在合格范围（0.5~2）之内，才能证明检测方法适用于该抗菌药物的微生物限度检测。为消除供试品的抑菌活性，微生物限度检测时可加入适宜的中和剂或灭活剂，如镁离子或钙离子。

3、但是喹诺酮类抗菌药物或三唑类抗真菌药物的药效团的结构极易与钙、镁、铁、锌等金属离子结合形成螯合物，从而影响药物的抗菌活性和检测方法；螯合物聚集对微生物限度检测会造成不利影响，如：（1）螯合物可能堵塞滤膜，阻断培养基的营养通道，影响菌落在培养基内部的生长和繁殖；（2）螯合物为菌落蔓延提供附着点使其在培养基表面繁殖，滤膜孔径小则允许菌落生长的空间更小，当菌落在培养基表面繁殖则会出现生长过大的情况，尤其是当铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌生长在培养基表面，即使在验证要求的菌数不超过100cfu的情况下，随着培养时间的延长，培养基表面的菌落会生长在一起，从而表现出边缘不清晰、无法计数或计数不准确的现象，无法保证上述五种菌株的回收率全部合格或准确，导致验证失败。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提供一种抗菌药物的微生物限度检测方法，旨在解决背景技术当中的至少一个技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、本发明提供一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其包括如下步骤：

4、s1、氯化钠溶液溶解抗菌药物，配制预设浓度的供试液；胰酪大豆胨琼脂培养基、中和剂混合制得固体的培养基a；胰酪大豆胨琼脂培养基制得固体的培养基b，所述培养基b中选择性加入显色剂、中和剂；中和剂采用氯化镁或氯化钙，显色剂采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑；所述抗菌药物为喹诺酮类抗菌药物或三唑类抗真菌药物；

5、s2、基于薄膜过滤法对供试液进行过滤处理，然后采用稀释剂对滤膜进行多次冲洗，并于最后一次冲洗时加入挑战菌；

6、s3、将滤膜的菌面朝上贴于培养基a中，再将培养基b覆盖于滤膜表面，构建由培养基a、滤膜、培养基b自下而上依次叠加的夹心结构；

7、s4、将制备好的夹心结构于30℃~35℃下培养，计数，计算回收率。

8、优选地，s1中，配制所述供试液时，抗菌药物与氯化钠溶液的比例为1g：（20~100）ml，氯化钠溶液的质量浓度为8%~10%；

9、所述培养基a中的中和剂的浓度为0.01mol/l~0.15mol/l；所述培养基b中的中和剂的浓度为0mol/l~0.1mol/l；

10、培养基b中显色剂的质量浓度范围为0~0.001%。

11、优选地，s2中，稀释剂采用质量浓度为8%~10%的氯化钠溶液，稀释剂对滤膜进行冲洗的次数≥5次；冲洗时，抗菌药物与稀释剂的总冲洗量的比例为1g：（500~1000）ml；s2的最后一次冲洗时，稀释剂中加入的挑战菌数量＜100cfu。

12、优选地，s2中，所述挑战菌采用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉。

13、优选地，当s1中所述培养基b中不包含中和剂与显色剂时，s2的稀释剂中包含浓度为0.01mol/l~0.15mol/l的中和剂。

14、优选地，s2中，基于薄膜过滤法对供试液进行过滤处理的步骤中，过滤时蠕动泵的转速为100r/min~300r/min。

15、优选地，s3中，抗菌药物与培养基a的比例为1g：（15~20）ml，抗菌药物与培养基b的比例为1g：（5~15）ml。

16、优选地，s4中，夹心结构于30℃~35℃下培养的时间≤3天。

17、优选地，所述喹诺酮类抗菌药物采用盐酸环丙沙星，所述三唑类抗真菌药物采用硫酸艾沙康唑。

18、本发明中采用夹心结构进行培养，主要包括以下2个方面的作用：

19、（1）夹心结构在一定程度上约束微生物生长过程中沿着滤膜上残余的螯合物蔓延，保证菌落在培养基内部生长繁殖，而不是培养基表面，避免微生物生长过大导致边缘粘连；生长在培养基内部的菌落会比较小，有效降低了粘连的概率；

20、（2）夹心结构为微生物菌落生长提供双通道的微生物营养，常规的双层结构只有滤膜提供微生物营养通道，若滤膜表面有微量螯合物残留，即使已经没有抑菌作用，但螯合物堵塞了部分营养输送通道，从而影响菌落生长，三层的夹心结构除了可以通过滤膜通道提供营养，还可以通过上层培养基提供菌落生长繁殖所需营养。

21、与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：

22、1.本发明采用夹心培养技术进行抗菌药物的微生物限度检测，检测金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉这五种菌株的回收率均合格且具有高度准确性。

23、2.本发明使用夹心培养技术，基于《中国药典》中的传统方法进行改良，将中和剂添加在双层培养基中，以盐酸环丙沙星、硫酸艾沙康唑为例的微生物限度方法学验证过程中，挑战菌的回收成功率均实现了有效提升，且挑战菌培养后边缘清晰，有利于计数。

1.一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，所述微生物限度检测方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s1中，配制所述供试液时，抗菌药物与氯化钠溶液的比例为1g：（20~100）ml，氯化钠溶液的质量浓度为8%~10%；

3.根据权利要求2所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s2中，稀释剂采用质量浓度为8%~10%的氯化钠溶液，稀释剂对滤膜进行冲洗的次数≥5次；冲洗时，抗菌药物与稀释剂的总冲洗量的比例为1g：（500~1000）ml；最后一次冲洗时，稀释剂中加入的挑战菌数量＜100cfu。

4.根据权利要求3所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s2中，所述挑战菌采用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌或黑曲霉。

5.根据权利要求3所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，当s1中所述培养基b中不包含中和剂与显色剂时，s2的稀释剂中包含浓度为0.01mol/l~0.15mol/l的中和剂。

6.根据权利要求1所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s2中，基于薄膜过滤法对供试液进行过滤处理的步骤中，过滤时蠕动泵的转速为100r/min~300r/min。

7.根据权利要求1所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s3中，抗菌药物与培养基a的比例为1g：（15~20）ml，抗菌药物与培养基b的比例为1g：（5~15）ml。

8.根据权利要求1所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，s4中，夹心结构于30℃~35℃下培养的时间≤3天。

9.根据权利要求1所述的一种抗菌药物的微生物限度检测方法，其特征在于，所述喹诺酮类抗菌药物采用盐酸环丙沙星，所述三唑类抗真菌药物采用硫酸艾沙康唑。