一种抗CD58单克隆抗体mAb-C1及其制备方法与应用

本发明涉及医学生物抗体，具体涉及一种能够特异性识别cd58的单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段以及制备方法与应用，还涉及编码该抗体的核苷酸、重组表达载体和宿主细胞，以及一种药物组合物。

背景技术：

1、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是原发性肝癌中最主要的病理类型，具有起病隐匿、肿瘤异质性强、侵袭转移能力强、术后复发率高等特点。尽管病毒性肝炎防治、影像学诊断、局部治疗、分子靶向治疗和免疫治疗不断发展，仍有较多患者在确诊时已处于中晚期，失去根治性手术机会，长期生存获益仍有待提高。

2、在现有hcc的治疗中，索拉非尼、仑伐替尼等多靶点小分子药物以及靶向pd-1/pd-l1、ctla-4或vegf/vegfr轴的抗体药物已用于hcc系统治疗。然而，并非所有患者均能获益，原发性耐药、获得性耐药、治疗相关不良反应和个体差异仍限制总体疗效。目前临床应用的抗体靶点相对集中，针对hcc细胞膜表面异常表达分子的抗体药物仍然不足，因而需要开发新的膜表面治疗靶点和相应单克隆抗体。

3、cd58又称淋巴细胞功能相关抗原3（lfa-3），属于免疫球蛋白超家族，是cd2的天然配体。cd58可形成糖基磷脂酰肌醇锚定型或跨膜型分子，其胞外区包含免疫球蛋白样结构域，参与免疫细胞与靶细胞之间的黏附、免疫突触形成以及t细胞和nk细胞功能调节。除经典免疫黏附功能外，cd58还具有肿瘤表达和组织特异性。在一些实体瘤中，cd58高表达与肿瘤细胞增殖、侵袭或不良预后相关。现有hcc研究对于cd58的表达模式和生物学作用尚未形成一致结论，且相关工作多停留于数据库分析、临床相关性或免疫功能评价层面。cd58是否能够直接参与hcc细胞内源性增殖信号，以及靶向cd58能否产生明确的抗肿瘤效果，仍缺少由特异性抗体介导的系统实验证据。因此，现有技术中缺少一种能够特异性、稳定识别肝细胞癌细胞膜表面天然构象cd58的单克隆抗体。

4、鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中缺少能够特异性、稳定识别肝细胞癌细胞膜表面天然构象cd58的单克隆抗体，解决现有技术中缺乏通过靶向cd58抑制hcc细胞增殖的直接干预手段和实验依据的问题，本发明提供了一种抗cd58单克隆抗体mab-c1，还提供了其制备方法和应用。本发明的抗体可以应用于生物药品制造，有望获得一种可治疗肝细胞癌的药物组合物。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明一方面提供了一种抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段，所述抗体mab-c1的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列。

4、进一步地，所述抗体mab-c1为具有全长重链和全长轻链的完整抗体分子，所述全长重链包含如seq id no:3所示的氨基酸序列，所述全长轻链包含如seq id no:4所示的氨基酸序列。

5、进一步地，所述抗原结合片段选自 fab、fab'、f(ab')2、fv或单链可变片段scfv。

6、本发明第二方面提供了一种核苷酸分子，编码如上任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段。

7、本发明第三方面提供了一种重组表达载体，包含如上所述的一种核苷酸分子。

8、本发明第四方面提供了一种宿主细胞，包括如上所述的重组表达载体。所述宿主细胞可为哺乳动物细胞，优选为cho细胞。

9、本发明第五方面提供了一种制备如上任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段的制备方法，包括：

10、（1）以编码cd58的mrna脂质纳米颗粒免疫动物；

11、（2）cd138阳性浆细胞富集及单细胞分选；

12、（3）单细胞裂解、cdna合成及抗体可变区扩增；

13、（4）mab-c1表达、纯化。

14、本发明第六方面提供了如上任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段在制备用于治疗肝细胞癌药物中的应用。

15、进一步地，所述药物用于抑制肝细胞癌细胞增殖、降低克隆形成能力、降低肿瘤组织ki67表达和/或抑制肿瘤生长。

16、本发明第七方面提供了一种药物组合物，包含如上任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段。药物组合物还包括药学上可接受的载体。

17、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

18、1、本发明的抗体mab-c1能够识别肝细胞癌细胞膜表面的天然构象cd58，其结合信号随cd58敲减而显著降低；该抗体能够抑制肝细胞癌细胞增殖和克隆形成，为靶向cd58抑制hcc细胞增殖提供直接实验依据。在mhcc97h裸鼠皮下移植瘤模型中，mab-c1使终点肿瘤体积和瘤重分别降低约61.12%和70.00%，并降低肿瘤组织ki67表达，且未见明显体重下降或主要脏器组织病理损伤。

19、2、本发明得到的cd58 mrna-lnp可使抗原在宿主细胞中表达并呈现膜定位和较接近天然状态的空间构象及翻译后修饰，有利于获得识别天然细胞表面cd58的抗体。免疫后小鼠血清在1:10000稀释度下仍显示高于阴性对照的结合信号。而抗体mab-c1经哺乳动物细胞表达和纯化后具有符合igg分子特征的重链和轻链，并可结合hcclm3和mhcc97h细胞膜表面cd58。流式细胞术显示，mab-c1在对照细胞中的阳性率为59.1%，而在cd58敲减细胞中降至6.88%，表明其结合具有明显cd58依赖性。

20、3.抗体的制备过程中采用cd138免疫磁珠富集和单细胞分选，富集后cd138阳性细胞比例达到85.9%，并获得8个候选单细胞，可提高目标抗体基因的获取效率。

1.一种抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体mab-c1的重链可变区包含seq id no:1所示的氨基酸序列，轻链可变区包含seq id no:2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体mab-c1为具有全长重链和全长轻链的完整抗体分子，所述全长重链包含如seqid no:3所示的氨基酸序列，所述全长轻链包含如seq id no:4所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自 fab、fab'、f(ab')2、fv或单链可变片段scfv。

4.一种核苷酸分子，其特征在于，编码如权利要求1~3任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段。

5.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求4所述的一种核苷酸分子。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种制备如权利要求1~3任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括：

8.如权利要求1~3任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段在制备用于治疗肝细胞癌药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物用于抑制肝细胞癌细胞增殖、降低克隆形成能力、降低肿瘤组织ki67表达和/或抑制肿瘤生长。

10.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1~3任一项所述的抗cd58单克隆抗体mab-c1或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。