一种检测次氯酸的比率型荧光探针及其制备方法与应用

本发明属于有机小分子荧光探针，具体涉及一种检测次氯酸的比率型荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术：

1、次氯酸（hocl）是生物体中十分重要的活性氧（ros）之一，主要是在髓过氧化物酶的催化下，由过氧化氢与氯离子发生化学反应而产生。hocl在生物体中扮演着复杂的角色：一方面，hocl是生物免疫系统的重要组成部分，当其含量处于正常范围时，可凭借其强氧化性抵御并清除侵入的细菌、病原体等外来物质，有助于维持细胞的正常生理功能、保持细胞内环境稳态；另一方面，过量积累或分布异常的hocl会导致细胞氧化损伤，诱发肺损伤、缺血再灌注损伤、风湿性关节炎、阿尔茨海默病甚至癌症等一系列疾病。因此，开发能够有效、灵敏地检测生物环境中hocl的简便方法，对于探究hocl在相关疾病中的诱发机制和作用途径具有重要意义。

2、传统的hocl检测方法主要包括碘还原滴定法、高效液相色谱法、化学发光法、分光光度法等。然而，上述方法普遍存在检测效果不佳、操作过程复杂等弊端；更重要的是，这些方法大多需要在加入各类有机溶剂的条件下使用，在以水为主的生物环境中往往受到限制。近年来，荧光探针技术发展迅猛，其在较大程度上克服了上述传统检测方法的弊端，不仅降低了检测成本、提高了hocl检测的准确性和选择性，而且在生物相容性等方面也有显著改善，已成为研究复杂生物环境中hocl含量和分布的重要手段之一。

3、目前已开发的用于检测次氯酸的小分子荧光探针，主要基于分子内电荷转移（ict）、扭曲分子内电荷转移（tict）、聚集诱导发光（aie）等机制进行设计，通过荧光强度、发射波长或荧光寿命的变化实现信号输出（参见：wajeeha zareen, nadeem ahmed,shahid raza, muhammad ali khan, zahid shafiq, recent development in dualfunction fluorescence probes for hocl and interaction with differentbioactive molecules, talanta 277 (2024) 126374. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2024.126374）。然而，目前已报道的次氯酸探针仍存在一些不足，例如发射波长较短、对次氯酸的灵敏度有限、难以在复杂生物样本中实现定量分析等。

4、因此，研究和开发具有长波长发射、比率型响应和高灵敏度的新型次氯酸荧光探针，对于生命科学、病理生理学、疾病诊断等相关领域具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种检测次氯酸的比率型荧光探针及其制备方法与应用。该探针具有发射波长长、斯托克斯位移大、比率型响应、灵敏度和选择性高等优点，可对次氯酸进行定量检测。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种检测次氯酸的比率型荧光探针，所述荧光探针为式（i）所示化合物，命名为ndt，其化学名称为(e)-n-(4-(2-(3-(二氰基亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)苯基)-2-(对甲苯磺酰基)肼-1-甲酰胺，分子式为c27h27n5o3s，为红色固体粉末，结构稳定；所述式（i）的结构如下：

4、

5、本发明荧光探针的设计原理如下：二氰基异佛尔酮类荧光团具有经典的给体-π共轭桥-受体（d-π-a）体系，其末端氨基为强电子给体。本发明利用磺酰肼基团对所述末端氨基进行保护，显著削弱其给电子能力，使分子内电荷转移（ict）效应受限，探针本身呈现较短的发射波长（576 nm）；当次氯酸存在时，次氯酸可特异性地氧化裂解磺酰肼基团，释放出末端氨基，恢复其强给电子能力，ict效应随之增强，探针的发射波长显著红移至638 nm，并伴随溶液颜色和荧光颜色的明显变化。由此，探针通过次氯酸诱导的磺酰肼基团转化，实现由短波发射向长波发射转变的比率型荧光响应；比率型信号可有效校正探针浓度、检测环境、激发光强度及仪器效率等因素引起的干扰，有利于提高检测的准确性。

6、第二方面，本发明提供上述比率型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：在氮气保护下，将(e)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈（化合物1）、对硝基苯基氯甲酸酯（化合物2）和三乙胺（化合物3）加入二氯甲烷中，搅拌进行反应；再向反应体系中加入对甲苯磺酰肼（化合物4）的二氯甲烷溶液，继续搅拌进行反应；反应结束后过滤，滤饼经二氯甲烷洗涤、干燥，得到式（i）所示化合物。

7、所述制备方法的反应式如下：

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9、优选地，所述化合物1、化合物2、化合物3与化合物4的投料摩尔比为1：1～3：3：1～3，进一步优选为1：1.4：3：1.4；所述反应在室温下进行，反应的总时间为24～72小时；以每毫摩尔化合物1计，所述二氯甲烷的总用量为10～25毫升。该制备方法为一锅法合成，路线短、条件温和、后处理简便、成本低廉。

10、第三方面，本发明提供上述比率型荧光探针在制备检测次氯酸的试剂中的应用，所述检测以非疾病的诊断和治疗为目的。

11、第四方面，本发明提供一种检测次氯酸的方法，利用上述比率型荧光探针进行检测，包括如下步骤：（1）向含有不同浓度次氯酸的磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液中，分别加入相同浓度的式（i）所示化合物，配制至少5种具有不同次氯酸浓度的标准溶液；（2）分别测定所述标准溶液在激发波长为420 nm条件下的荧光发射光谱，记录576 nm波长处的荧光强度值i576以及638 nm波长处的荧光强度值i638，计算两者的比值i638/i576，以次氯酸浓度为横坐标、以所述比值为纵坐标，建立标准曲线；（3）向待测样品中加入式（i）所示化合物，使其浓度与所述标准溶液中式（i）所示化合物的浓度相同，在相同条件下测定其荧光发射光谱，计算比值i638/i576，根据所述标准曲线计算得到待测样品中次氯酸的含量；所述方法以非疾病的诊断和治疗为目的。优选地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为10 mm、ph值为7.4，混合溶液中磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为4：1；所述标准溶液中式（i）所示化合物的浓度为10nm～10 μm，次氯酸的浓度为0.1 nm～1 mm。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、（1）本发明提供的荧光探针ndt为红色固体粉末，结构稳定，可通过一锅法合成获得，制备路线短、操作简便、成本低廉，易于推广和应用。

14、（2）本发明提供的荧光探针可实现比率型荧光检测：未加入次氯酸时，探针的最大发射波长为576 nm；随着次氯酸的加入，638 nm波长处出现新的发射峰并逐渐增强，576 nm波长处发射峰逐渐减弱，荧光强度比值i638/i576与次氯酸浓度呈现良好的线性关系（r2 =0.992），可用于次氯酸浓度的精确定量测量。比率型信号可有效校正探针浓度、环境和仪器等因素的干扰。

15、（3）本发明提供的荧光探针激发波长为420 nm、发射波长位于576～638 nm的长波区域，具有斯托克斯位移大（可达218 nm）、背景干扰小的特点；伴随次氯酸的加入，探针溶液在日光下颜色由浅黄色变为深黄色，在365 nm紫外灯下荧光由橙黄色变为红色，可视化效果明显。

16、（4）本发明提供的荧光探针对次氯酸具有优异的选择性，常见的活性氧、金属离子及生物硫醇等共存物质对检测无明显干扰。