一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗的制备方法与应用

本发明涉及生物制品，尤其涉及一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、鸡传染性贫血（chicken infectious anemia, cia）是由圆环病毒科环病毒属鸡传染性贫血病毒（chicken infectious anemia virus, ciav）引起的一种免疫抑制性疾病，主要感染20日龄以内的雏鸡，导致淋巴组织萎缩、再生障碍性贫血且常常伴随其它病毒、细菌或真菌的感染，给养禽业带来了巨大的经济损失。目前，尚无特效的药物治疗该病，疫苗防控早期感染是控制ciav的关键。ciav在鸡胚和msb1细胞中的病毒滴度都较低，使得ciav灭活疫苗的生产成本很高，难以在养鸡业大量推广应用。使用cav活疫苗存在垂直和水平传播的风险，不能推广应用。因此，及时进行ciav分子流行病学调查，掌握流行毒株基因组特点，制备新型基因工程疫苗是目前研究的主要方向。

2、病毒样颗粒（virus-like particles, vlps）疫苗因其自身安全性、生产简便性以及免疫特性而成为现代疫苗研究的热点。vlps是由一种或多种蛋白组装形成的类似病毒形态的空心颗粒。vlps与病毒结构高度相似，不含有病毒遗传物质，不具有复制能力与感染性，能激活宿主天然免疫和获得性免疫反应。特别是，与灭活疫苗或单一病毒蛋白或多肽相比，vlps疫苗具有经济、安全、高效及有利于疾病净化等优势，是最有可能替代传统灭活疫苗的抗原形式。据国内外研究，vlps在人和动物的多种传染病、抗肿瘤方面均已取得显著成果，且市面上已拥有乙肝、人乳头状瘤、戊肝以及猪圆环病毒等商品化的vlps疫苗。但目前，关于鸡传染性贫血病毒样颗粒疫苗在体外重组表达的相关研究则少见报道。

3、表位疫苗（epitope vaccine）一般指利用生物信息学、结构生物学以及分子免疫学等多个交叉学科，筛选出病毒有效抗原表位并模拟其空间构象以间隔序列（linker）串联起来，应用基因工程技术进行体外表达或者人工合成微生物抗原表位高效表达并纯化后加入免疫增强剂将其制备而成的疫苗。表位疫苗具有容易生产、工艺低廉、安全性高、稳定性好、无散毒风险等优点。vp1也是ciav最主要的结构蛋白，具有多种中和表位，对ciav的复制与传播至关重要。vp2蛋白的存在是vp1蛋白形成正确构象的必要条件，只有当vp1、vp2蛋白同时存在才能诱导机体产生针对ciav的抗体。目前，ciav结构蛋白优势抗原表位筛选与融合表达形成vlps及其免疫机制的研究国内外还处于空白状态。

4、因此，为了应对ciav的不断变异，研发安全有效的cia疫苗，本发明设计了一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗的制备方法。即通过选取鸡传染性贫血vp1蛋白上序列较保守且能引发中和反应产生抗体的多个表位肽基因序列用柔性linker连接起来插入到vp1基因表达框前面，再通过杆状病毒真核表达系统自组装成病毒样颗粒。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒，其能刺激机体产生良好的免疫应答，可应用于制备疫苗中，具有巨大的开发潜力。 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种重组转移载体，以pfastbac-dual为骨架，将编码融合蛋白epitope-vp1的基因片段插入ph启动子下游的ecor i与sal i酶切位点之间，将编码vp2蛋白的基因片段插入p10启动子下游的xho i与nhe i酶切位点之间；所述融合蛋白epitope-vp1自氨基端至羧基端依次包含通用型th表位padre、b细胞表位b1、b2、b3、b4、b5和鸡传染性贫血病毒vp1蛋白，相邻b细胞表位之间以柔性肽连接，b细胞表位b5与vp1蛋白之间以柔性肽ggggs连接，编码所述融合蛋白epitope-vp1的基因的核苷酸序列如seq idno:1所示，编码所述vp2蛋白的基因的核苷酸序列如seq id no:10所示。

2、其中，所述表位多肽 epitope-vp1的基因序列，如seq id no：1所示；所述通用型th表位，如seq id no：2所示；所述b细胞表位多肽b1，如seq id no：3所示；所述b细胞表位多肽b2，如seq id no：4所示；所述b细胞表位多肽b3，如seq id no：5所示；所述b细胞表位多肽b4，如seq id no：6所示；所述b细胞表位多肽b5，如seq id no：7所示。

3、一种重组杆粒，是将所述重组转移载体转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，经蓝白斑筛选及pcr鉴定获得的重组杆粒rbac-epitope-vp1-vp2。

4、一种重组杆状病毒，是将所述重组杆粒转染至sf9昆虫细胞进行培养，从培养物中收获重组杆状病毒repitope-vp1-vp2。

5、一种应用所述重组杆粒制备鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒的方法，将所述重组杆粒转染至sf9昆虫细胞进行培养，收获重组杆状病毒并连续传代扩增后，接种high five昆虫细胞进行表达，从培养物中经蔗糖密度梯度离心纯化得到鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒。

6、优选的，所述的方法包括以下步骤： 将通用型th表位序列和通过生物信息学筛选得到的vp1蛋白b细胞表位序列经柔性肽串联，插入到鸡传染性贫血病毒vp1蛋白氨基端，其基因片段命名为epitope-vp1，并化学合成基因片段epitope-vp1，如seq id no：1所示。 以载体pfastbac-dual为骨架，将基因片段epitope-vp1插入到酶切位点ecor i和sal i之间，将vp2基因片段插入到酶切位点xho i和nhe i之间，得到正确的重组转移质粒pfastbac-dual-epitope-vp1-vp2。

7、将获得的重组转移质粒pfastbac-dual-epitope-vp1-vp2转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，获得重组杆粒rbac-epitope-vp1-vp2。 将重组杆粒转染sf9昆虫细胞，利用间接免疫荧光、western blot鉴定表达的重组蛋白。

8、收集重组杆粒转染sf9昆虫细胞的上清，即获得重组杆状病毒p1代毒，继续在sf9细胞中连续传代两次，通过western blot和间接免疫荧光检测融合蛋白的表达情况，蛋白经纯化后通过电镜观察病毒样颗粒形成情况，制备ciav多表位嵌合vlps。 一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒，是用所述方法制备得到的，由seq id no:8所示融合蛋白epitope-vp1与seq id no:9所示的vp2蛋白共组装形成。

9、优选的，所述融合蛋白epitope-vp1的氨基酸序列如seq id no:8所示，所述vp2蛋白的氨基酸序列如seq id no:9所示。

10、一种鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗，包括所述的病毒样颗粒和疫苗佐剂。

11、优选的，所述病毒样颗粒为经蔗糖密度梯度离心纯化后的病毒样颗粒。

12、进一步优选的，所述疫苗佐剂为白油佐剂与吐温80组成的油包水型佐剂。

13、所述的重组转移载体、所述的重组杆粒、所述的重组杆状病毒、所述的鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒在制备预防鸡传染性贫血的药物中的应用。

14、进一步的方案，所述鸡传染性贫血病毒多表位嵌合病毒样颗粒疫苗的制备方法包括以下步骤：

15、（1）将所述的重组杆状病毒接种昆虫细胞，3天后收获昆虫细胞上清液；

16、（2）将所述的昆虫细胞上清液通过纯化收获较为纯净的鸡传染性贫血病毒样颗粒；

17、（3）将所述的病毒样颗粒与佐剂混合，得到所述ciav病毒样颗粒疫苗。

18、进一步的方案，所述（1）中的昆虫细胞为high five细胞。

19、进一步的方案，所述（2）中的纯化方式为蔗糖梯度密度离心。

20、进一步的方案，所述（3）中的佐剂类型为白油佐剂。

21、本发明的有益效果为：

22、本发明首先运用生物信息学技术，将鸡传染性贫血病毒vp1蛋白优势抗原表位筛选出来，与通用型th表位一起，巧妙利用柔性肽串联至vp1蛋白编码序列氨基端进行融合表达。构建的多表位嵌合vlps既有vlps的优点，又有表位疫苗的优点，在一定程度上优于常规表位研究的表达质粒和蛋白形式。

23、目前尚未有报道利用ciav vlps作为呈现平台展示同种或异种病原表位的相关研究。本发明着眼于vlps具有极强的安全性和免疫原性的优点，借鉴其表面能够重复高密度的表达或携带抗原表位、小分子物质的特点，首次将ciav vp1的优势抗原表位与vp1进行同步展示，构建嵌合vlps并对其免疫应答机制进行研究，为今后开展安全高效广谱的新型多联多价疫苗的研发提供理论基础和技术支撑。

24、本发明从动物疫病的最终净化视角建立优势防控技术，以高纯度的病毒样颗粒为优势抗原研发不同疫苗制剂，不仅在生产和应用中省时、省力、节约成本，还有最大限度激发动物免疫应答。