一种猪δ冠状病毒减毒株及其构建方法和应用

本发明涉及生物，特别是涉及一种猪δ冠状病毒减毒株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、猪δ冠状病毒（pdcov）是危害生猪养殖业的重要病原，该病毒主要侵袭仔猪，极易引发急性腹泻、呕吐、脱水等病症，患病仔猪死亡率偏高，同时病毒传播范围广、传播能力强，在我国及世界多个养猪产区均有流行，持续造成规模化猪场重大经济损失，严重制约生猪产业健康发展。

2、目前临床上针对pdcov的防控体系仍存在明显短板。主流防控产品以传统灭活疫苗、常规减毒疫苗为主，其中灭活疫苗普遍存在免疫原性偏弱、抗体持续时间短的问题，难以提供全面有效的免疫保护；依靠体外连续传代获得的传统减毒疫苗，存在减毒程度不可控、选育周期长、毒株遗传稳定性差等缺陷，还潜藏毒力返强的安全风险，无法完全满足规模化养殖的防疫需求。同时，现有抗病毒药物仅能起到辅助缓解作用，无法从根源上阻断病毒感染与传播。

3、从病毒学研究来看，刺突蛋白（s）是pdcov的核心功能蛋白，直接参与病毒识别宿主细胞、膜融合、入侵等关键过程，同时也是激发机体产生保护性抗体的主要抗原靶点。该蛋白在不同地域、不同流行毒株中序列高度保守，是开展病毒定向改造、研发新型疫苗的理想靶点。但当前行业内针对pdcov s蛋白的基因改造技术应用有限，传统基因编辑手段操作复杂、突变位点精准度不足，难以定向调控病毒毒力与免疫原性。

4、现阶段行业缺少基于病毒核心抗原蛋白精准改造的技术方案，无法同步实现病毒减毒、保留高免疫活性、毒株稳定传代等多重目标。因此，依托反向遗传学与基因编辑技术，对pdcov进行定向改造，开发出毒力弱、免疫效果好、遗传稳定的新型减毒株，并拓展其疫苗应用场景，成为当下pdcov防控领域亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种猪δ冠状病毒减毒株及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明提供的猪δ冠状病毒减毒株的复制与致病性弱，免疫原性强，遗传稳定，可用于疫苗及相关药物研发。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种猪δ冠状病毒减毒株，所述猪δ冠状病毒减毒株是通过对野生型猪δ冠状病毒的刺突蛋白的棕榈酰化位点进行定点突变获得；

4、所述定点突变为将所述刺突蛋白的棕榈酰化位点的半胱氨酸突变为丝氨酸。

5、进一步地，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为以下5个位点中的任意一个、两个或三个：所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位、第1124位、第1128位、第1131位和第1135位氨基酸。

6、进一步地，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为以下5个位点中的任意一个：所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位、第1124位、第1128位、第1131位和第1135位氨基酸。

7、进一步地，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位和第1128位氨基酸。

8、本发明还提供一种上述的猪δ冠状病毒减毒株的构建方法，包括以下步骤：

9、针对目标突变位点设计突变引物、同源臂引物及sgrna；

10、以携带野生型猪δ冠状病毒全基因组的感染性克隆质粒为模板，利用pcr扩增获得含定点突变位点的目的基因片段，通过融合pcr拼接完整突变片段；

11、采用crispr/cas9基因编辑技术对载体进行酶切，将拼接后的突变基因片段与线性化载体进行同源重组，构建携带刺突蛋白定点突变的重组质粒；

12、将所述重组质粒转染宿主细胞，进行病毒拯救、传代培养，经鉴定获得所述猪δ冠状病毒减毒株。

13、本发明还提供上述的猪δ冠状病毒减毒株在制备猪δ冠状病毒减毒活疫苗中的应用。

14、本发明还提供一种猪δ冠状病毒减毒活疫苗，包括上述的猪δ冠状病毒减毒株。

15、进一步地，所述猪δ冠状病毒减毒活疫苗还包括疫苗佐剂。

16、本发明还提供棕榈酰化抑制剂在制备抑制猪δ冠状病毒复制的药物中的应用。

17、进一步地，所述棕榈酰化抑制剂为2-溴棕榈酸。

18、本发明公开了以下技术效果：

19、本发明通过定点突变改造pdcov s蛋白棕榈酰化位点，获得了遗传稳定性优良的减毒株。体外实验表明，突变后病毒复制能力显著下调，部分毒株病毒滴度降幅可达0.625个对数滴度，有效削弱病毒体外增殖能力。动物模型试验证实，该减毒株感染乳鼠后，肠道病毒载量、促炎因子表达水平显著降低，肠道组织出血、绒毛萎缩等病理损伤大幅减轻，体内致病性明显减弱。同时，本发明改造的减毒株可高效诱导机体产生特异性igg抗体与高滴度中和抗体，中和抗体效价最高可达1:128，免疫原性优于野生毒株。此外，本发明构建的减毒株经连续传代后突变位点未发生变异，遗传性能稳定，不存在毒力返强风险，可安全用于制备pdcov减毒活疫苗，也为靶向棕榈酰化通路的抗病毒药物研发提供了全新实验基础与靶点支撑。

1.一种猪δ冠状病毒减毒株，其特征在于，所述猪δ冠状病毒减毒株是通过对野生型猪δ冠状病毒的刺突蛋白的棕榈酰化位点进行定点突变获得；

2.如权利要求1所述的猪δ冠状病毒减毒株，其特征在于，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为以下5个位点中的任意一个、两个或三个：所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位、第1124位、第1128位、第1131位和第1135位氨基酸。

3.如权利要求2所述的猪δ冠状病毒减毒株，其特征在于，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为以下5个位点中的任意一个：所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位、第1124位、第1128位、第1131位和第1135位氨基酸。

4.如权利要求2所述的猪δ冠状病毒减毒株，其特征在于，所述刺突蛋白的棕榈酰化位点为所述刺突蛋白的氨基酸序列的第12位和第1128位氨基酸。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的猪δ冠状病毒减毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.一种如权利要求1-4任一项所述的猪δ冠状病毒减毒株在制备猪δ冠状病毒减毒活疫苗中的应用。

7.一种猪δ冠状病毒减毒活疫苗，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的猪δ冠状病毒减毒株。

8.如权利要求7所述的猪δ冠状病毒减毒活疫苗，其特征在于，所述猪δ冠状病毒减毒活疫苗还包括疫苗佐剂。

9.棕榈酰化抑制剂在制备抑制猪δ冠状病毒复制的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述棕榈酰化抑制剂为2-溴棕榈酸。