IL-23结合分子及其用途的制作方法

本发明属于抗体药物领域，具体地，涉及一种il-23结合分子及其用途。

背景技术：

1、白细胞介素-23(interleukin-23，il-23)是一种重要的细胞因子，属于il-12家族，在免疫系统中扮演着关键角色。il-23以由两个亚基(p19亚基和p40亚基)通过二硫键连接形成的异二聚体的形式存在，其结构域通常包括一个n端的信号肽、一个β折叠结构以及一个α螺旋结构，结合后形成一个特定的立体构象，使其能够与细胞表面的il-23受体(il-23r)结合。il-23主要由巨噬细胞和树突细胞产生，其在免疫应答中的主要生物学功能包括：(1)促进th17细胞的分化与存活：il-23能够通过激活naive t细胞分化为th17细胞，th17细胞在自身免疫性疾病和炎症过程中发挥重要作用；(2)增强细胞因子的产生：il-23刺激th17细胞和其他免疫细胞释放多种细胞因子，如il-17、il-22等，进而调节炎症反应；(3)支持慢性炎症：在多种慢性炎症疾病(如银屑病、克罗恩病、强直性脊柱炎等)中，il-23表现出促进病理性炎症的作用；(4)增强nk细胞和细胞毒性t细胞的活性：il-23还可能通过刺激nk细胞和cd8+t细胞的激活，促进抗肿瘤免疫和抗感染反应。

2、由于il-23在维持th17细胞功能方面的作用，它与多种免疫性和炎症性疾病相关。除了炎症性肠病(ibd)，包括克罗恩病(crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)，il-23也在银屑病、风湿性关节炎和多发性硬化症等疾病中发挥作用。在这些病理条件下，il-23促进炎症反应的维持，导致组织损伤和疾病进展。

3、靶向il-23的药物可用于il-23相关的免疫性和炎症性疾病的防治。然而，已报道的靶向il-23的p19亚基(il-23p19)的单域抗体活性不及上市单抗。因此，开发具有高活性的抗il-23单域抗体具有重要的价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有更高活性的抗il-23单域抗体及其抗原结合片段，以及所述抗il-23单域抗体及其抗原结合片段在疾病诊断和治疗中的应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种抗il-23单域抗体或其抗原结合片段，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段的vhh链包含选自下组的互补决定区(cdr)：

3、(z1)seq id no:2所示的cdr1，seq id no:3所示的cdr2和seq id no:4所示的cdr3；或

4、(z2)seq id no:20所示的cdr1，seq id no:21所示的cdr2和seq id no:22所示的cdr3。

5、在另一优选例中，上述氨基酸序列中任一氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留il-23结合亲和力的衍生序列。

6、在另一优选例中，所述vhh链还包含框架区(fr)。

7、在另一优选例中，所述框架区(fr)包括骆驼源fr和人源fr。

8、在另一优选例中，所述框架区(fr)包括fr1、fr2、fr3和fr4。

9、在另一优选例中，所述vhh链包含以下fr：

10、(1)seq id no:5所示的fr1、seq id no:6所示的fr2、seq id no:7所示的fr3和seq id no:8所示的fr4；

11、(2)seq id no:12所示的fr1、seq id no:13所示的fr2、seq id no:15所示的fr3和seq id no:18所示的fr4；

12、(3)seq id no:12所示的fr1、seq id no:13所示的fr2、seq id no:16所示的fr3和seq id no:18所示的fr4；或

13、(4)seq id no:12所示的fr1、seq id no:14所示的fr2、seq id no:17所示的fr3和seq id no:18所示的fr4。

14、在另一优选例中，所述vhh链包含以下fr：

15、(1)seq id no:23所示的fr1、seq id no:24所示的fr2、seq id no:25所示的fr3和seq id no:8所示的fr4；或

16、(2)seq id no:27所示的fr1、seq id no:24所示的fr2、seq id no:25所示的fr3和seq id no:18所示的fr4。

17、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段的vhh链具有与如seqid no:1、9-11中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。

18、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段的vhh链具有与如seqid no:19或26中所示的氨基酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。

19、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段的vhh链具有如seq idno:1、9-11中任一项所示的氨基酸序列。

20、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段的vhh链具有如seq idno:19或26所示的氨基酸序列。

21、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体包括骆驼源单域抗体、嵌合单域抗体或人源化单域抗体。

22、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。

23、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体为二价体，优选地为异源二价体。

24、在另一优选例中，所述异源二聚体包括两条不同序列的vhh链，且两条vhh链之间通过连接肽连接；优选地，所述连接肽选自选自(gs)n、(ggs)n、(gggs)n、(ggggs)n，其中n为1-5的正整数。

25、在另一优选例中，所述异源二价体包括一条具有如seq id no:1、9-11中任一项所示的氨基酸序列的vhh链，和一条具有如seq id no:19或26所示的氨基酸序列的vhh链。

26、在另一优选例中，所述异源二价体包括一条具有如seq id no:9-11中任一项所示的氨基酸序列的vhh链，和一条具有如seq id no:26所示的氨基酸序列的vhh链。

27、在另一优选例中，所述异源二价体具有如seq id no:28-30中任一项所示的氨基酸序列。

28、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段特异性结合人il-23和食蟹猴il-23。

29、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段为阻断型抗体，阻断il-23与il-23r结合。

30、在另一优选例中，所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段特异性结合il-23的p19亚基。

31、在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从n端到c端的结构如式ia或ib所示：

32、a-l-b(ia)；

33、b-l-a(ib)；

34、其中，

35、a为如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段；

36、b为igg的fc片段；和

37、l为无或柔性接头。

38、在另一优选例中，所述柔性接头为肽接头。

39、在另一优选例中，所述肽接头具有1-50个氨基酸，较佳地1-20个氨基酸。

40、在另一优选例中，所述肽接头选自(gs)n、(ggs)n、(gggs)n、(ggggs)n，其中n为1-5的正整数。

41、在另一优选例中，所述肽接头具有(ggggs)n的结构，其中n为1-5的正整数。

42、在另一优选例中，所述igg的fc片段包括人的igg的fc片段。

43、在另一优选例中，所述igg的fc片段选自下组：igg1、igg2、igg3、igg4的fc片段、或其组合。

44、在本发明的第三方面，提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包含如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、或如本发明第二方面所述的融合蛋白。

45、在另一优选例中，所述多特异性抗体包括双特异性抗体、三特异性抗体等。

46、在另一优选例中，所述多特异性抗体为双特异性抗体。

47、在另一优选例中，所述双特异性抗体包括如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段，以及抗tnf样配体1a(tl1a)单域抗体。

48、在另一优选例中，所述抗tl1a单域抗体包含氨基酸序列如seq id no:35所示的vhh链。

49、在另一优选例中，所述双特异性抗体包含fc区，所述fc区包含能够相互缔和的第一亚基fc1和第二亚基fc2。

50、在另一优选例中，所述fc1具有根据杵臼技术(knob-in-hole)的凸起结构(knob)，和所述fc2具有根据杵臼技术的孔结构(hole)。

51、在另一优选例中，所述fc1包含如seq id no:31所示的氨基酸序列，且所述fc2包含如seq id no:32所示的氨基酸序列。

52、在另一优选例中，所述fc1包含如seq id no:33所示的氨基酸序列，且所述fc2包含如seq id no:34所示的氨基酸序列。

53、在另一优选例中，所述双特异性抗体的包含如下式(iia)和(iib)所示的两条肽链：

54、c1-l1-fc1(iia)

55、c2-l2-fc2(iib)

56、其中，“-”为肽键；

57、l1和l2各自独立地为无或接头元件；

58、c1为如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段，且c2为抗tl1a单域抗体；或者c1为抗tl1a单域抗体，且c2为如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段；和

59、fc1为抗体的fc区的第一亚基，fc2为抗体fc区的第二亚基。

60、在另一优选例中，在所述双特异性抗体中，所述抗il-23单域抗体的氨基酸序列如seq id no:28-30中任一项所示，优选地，如seq id no:29或30所述；并且

61、所述抗tl1a单域抗体的氨基酸序列如seq id no:35所示。

62、在本发明的第四方面，提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白具有：

63、(i)如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段；和

64、(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

65、在另一优选例中，所述的标签序列包括fc标签、ha标签和his标签。

66、在本发明的第五方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白：如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、或如本发明第四方面所述的重组蛋白。

67、在另一优选例中，所述多核苷酸包括dna或rna。

68、在本发明的第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第五方面所述的多核苷酸。

69、在另一优选例中，所述表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

70、在另一优选例中，所述表达载体包括病毒载体，如腺病毒、aav病毒、逆转录病毒、慢病毒、或其组合。

71、在本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第六方面所述的表达载体，或基因组中整合有如本发明第五方面所述的多核苷酸。

72、在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

73、在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体、或其组合。

74、在另一优选例中，所述原核细胞选自下组：大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸菌、链霉菌、奇异变形菌、或其组合。

75、在另一优选例中，所述真核细胞选自下组：毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉、或其组合。

76、在另一优选例中，所示真核细胞选自下组：草地粘虫等昆虫细胞、烟草等植物细胞、bhk细胞、cho细胞、cos细胞、骨髓瘤细胞、或其组合。

77、在另一优选例中，所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选hek293细胞、cho细胞、bhk细胞、nso细胞或cos细胞。

78、在本发明的第八方面，提供了一种产生抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、或其融合蛋白、本发明第三方面所述的多特异性抗体、或本发明第四方面所述的重组蛋白的方法，包括步骤：

79、(a)在适合蛋白表达的条件下，培养如本发明第七方面所述宿主细胞，从而获得含所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、或其融合蛋白、所述多特异性抗体、所述重组蛋白的培养物；

80、(b)从所述培养物中分离或回收所述抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、或其融合蛋白、所述多特异性抗体、所述重组蛋白；以及

81、在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(c)纯化和/或修饰得步骤(b)中获得的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、或其融合蛋白、多特异性抗体、重组蛋白。

82、在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

83、(i)如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、或如本发明第四方面所述的重组蛋白；以及

84、(ii)药学上可接受的载体。

85、在另一优选例中，所述药物组合物为注射剂型。

86、在另一优选例中，所述药物组合物用于制备预防和/或治疗il-23介导的免疫性和炎症性疾病。

87、在另一优选例中，所述il-23介导的免疫性和炎症性疾病包括但不限于：炎症性肠病(ibd)，例如克罗恩病(crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)；银屑病、风湿性关节炎、掌跖脓疱病、银屑病关节炎、化脓性汗腺炎、毛发红糠疹、巨细胞动脉炎、坏疽性脓皮病、狼疮性肾炎、家族性良性天疱疮、代谢相关脂肪性肝病、强直性脊柱炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、白癜风、哮喘、特应性皮炎和多发性硬化症。

88、在另一优选例中，所述药物组合物中还可以包含其他预防和/或治疗免疫性和炎症性疾病的药物。

89、在本发明的第十方面，提供了一种il-23抑制剂，所述抑制剂包含如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、或如本发明第四方面所述的重组蛋白。

90、在另一优选例中，所述抑制剂通过阻断il-23与il-23r的结合从而抑制il-23的活性。

91、在本发明的第十一方面，提供了如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、或如本发明第四方面所述的重组蛋白的用途，用于制备：

92、(a)用于预防和/或治疗il-23介导的疾病或病症的药物；或

93、(b)用于检测il-23分子的检测试剂、检测板或检测试剂盒。

94、在另一优选例中，所述il-23介导的疾病或病症包括免疫性和炎症性疾病，包括但不限于：炎症性肠病(ibd)，例如克罗恩病(crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)；银屑病、风湿性关节炎、掌跖脓疱病、银屑病关节炎、化脓性汗腺炎、毛发红糠疹、巨细胞动脉炎、坏疽性脓皮病、狼疮性肾炎、家族性良性天疱疮、代谢相关脂肪性肝病、强直性脊柱炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、白癜风、哮喘、特应性皮炎和多发性硬化症。

95、在另一优选例中，所述检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测、elisa检测。

96、在另一优选例中，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。

97、在本发明的第十二方面，提供了一种检测样品中il-23蛋白的方法，所述方法包括步骤：

98、(1)将样品与如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、或如本发明第四方面所述的重组蛋白接触；

99、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在il-23蛋白。

100、在另一优选例中，所述方面为体外方法。

101、在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗性的方法。

102、在本发明的第十三方面，提供了一种治疗il-23介导的疾病或病症的方法，所述方法包括，给有需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗il-23单域抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的融合蛋白、如本发明第三方面所述的多特异性抗体、如本发明第四方面所述的重组蛋白、或如本发明第九方面所述的药物组合物。

103、在另一优选例中，所述对象包括哺乳动物，如人。

104、在另一优选例中，所述对象体内的il-23异常表达。

105、在另一优选例中，所述il-23介导的疾病或病症包括免疫性和炎症性疾病，包括但不限于：炎症性肠病(ibd)，例如克罗恩病(crohn's disease)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)；银屑病、风湿性关节炎、掌跖脓疱病、银屑病关节炎、化脓性汗腺炎、毛发红糠疹、巨细胞动脉炎、坏疽性脓皮病、狼疮性肾炎、家族性良性天疱疮、代谢相关脂肪性肝病、强直性脊柱炎、非放射学中轴型脊柱关节炎、白癜风、哮喘、特应性皮炎和多发性硬化症。

106、应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。