一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分与分离方法

本发明属于生物纳米检测及分离纯化，尤其涉及一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分与分离方法。

背景技术：

1、低密度脂蛋白（low density lipoprotein, ldl）是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒，不仅在物质转运中发挥关键作用，还广泛参与机体的多种生理活动。该脂蛋白胆固醇含量丰富，易在血管内壁沉积，推动动脉粥样硬化发展，因此俗称坏胆固醇。正常生理条件下，ldl能够完成机体常规的胆固醇转运工作；但一旦发生氧化修饰，便会转化为氧化型低密度脂蛋白（ox-ldl）。ox-ldl致病能力显著提升，可被血管壁巨噬细胞靶向摄取，造成胞内脂质过量堆积，促使巨噬细胞转变为泡沫细胞。这类细胞不断堆积在血管内皮下，逐步形成脂质条纹，继而发展为纤维斑块，损伤血管结构，最终诱发动脉粥样硬化及各类相关心血管病症。样品纯度对于ldl的相关生理与病理研究是非常重要的，而sev是样品纯度的重要挑战。

2、小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sev)是由脂质双分子层组成的细胞衍生膜囊泡，是细胞间信息传递的重要介导物质，广泛适用于病理、生理学中的治疗、诊断和机制成分。两种物质在大小、形状和密度上高度重叠，并且甚至可能发生相互作用，形成复合物。然而，目前现有的分离技术，如常用的超速离心、尺寸排阻色谱法均是基于物理性质进行实现，其中产量与纯度均受到了污染物的影响。另外鉴别技术，如蛋白质免疫印迹（western blot）、动态光散射、形貌表征等方法并不足以排除污染物的存在。并且，现有常用的脂蛋白的纯化方法主要是超速离心，亲和层析等方法，均存在设备或材料要求高、处理量小或周期长等问题。因此，目前实现小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分与分离仍具有挑战并且至关重要。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分与分离方法，其目的在于解决背景技术中所提到的问题。

2、第一方面，本发明提供一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分方法，包括：将待测样品均分为三组；第一组待测样品加入 pbs 缓冲溶液维持正常渗透压；第二组待测样品加入超纯水，构建低渗环境；第三组待测样品加入质量分数为1.8%的氯化钠溶液，构建高渗环境；三组待测样品均静置20min 后，分别进行形貌和粒径检测；

3、根据所述待测样品在正常、低和高渗透压下的形貌和粒径的检测结果，判断所述待测样品为小细胞外囊泡，或者为低密度脂蛋白。

4、进一步地，所述低渗溶液为超纯水，所述高渗溶液为1.8%氯化钠溶液。

5、进一步地，当检测所述待测样品在不同渗透压下的形貌与粒径无变化时，判断所述待测样品为低密度脂蛋白；当检测所述待测样品在低渗透压下发生膨胀，粒径增大，并且所述待测样品在高渗透压下发生皱缩，粒径减小，判断所述待测样品为小细胞外囊泡。

6、细胞外囊泡主要由磷脂双分子层构成，类似于细胞膜。磷脂双分子层的两侧是亲水性的头部，中间是疏水性的尾部。当外部环境渗透压改变时，由于细胞外囊泡内部内外形成浓度差，水分子会顺着浓度梯度（渗透压梯度）进出。而低密度脂蛋白的中心部分具有疏水性，外层具有亲水性。这种结构像一个保护壳，当外部渗透压改变时，亲水性的外层能够在一定程度上缓冲外部环境的影响。即当外界环境中的渗透压发生变化时，细胞外囊泡的尺寸与粒径会随着一起变化，而低密度脂蛋白并不会受到渗透压的影响。

7、第二方面，本发明提供一种低密度脂蛋白的分离方法，包括以下步骤：

8、步骤一、将待提取样本加入低渗溶液，调整渗透压至低渗透压，静置后，过滤；

9、步骤二、收集过滤后的溶液，加入高渗溶液，调整渗透压至正常渗透压，得到调整渗透压后的溶液；

10、步骤三、调整渗透压后的溶液采用差速超速离心法分离，收集沉淀，即得到低密度脂蛋白。

11、进一步地，所述步骤一中，所述低渗溶液为超纯水。

12、进一步地，所述步骤一中，静置60min。

13、进一步地，所述步骤一中，使用无菌0.1μm滤膜过滤。

14、进一步地，所述步骤二中，所述高渗溶液为1.8%氯化钠溶液。

15、进一步地，所述步骤三中，所述差速超速离心法具体为：调整渗透压后的溶液于4℃、10000×g离心60min，收集上清液，再于4℃、250000×g离心70min。

16、本发明具有如下有益效果：

17、（1）保持结构完整性：在低渗或高渗处理下，小细胞外囊泡会发生膨胀或皱缩，但膜结构保持完整；而低密度脂蛋白并不会发生变化。这种方法可避免使用破坏性试剂，保留细胞外囊泡与低密度脂蛋白的天然形态和内容物。

18、（2）避免外源标记或抗体依赖：传统方法依赖亲和方法，但可能引入异源抗体或非特异性结合。渗透压调控纯属物理手段，无化学修饰，更利于临床样本的标准化处理。

19、（3）高效率：操作流程简洁，省去孵育、洗膜、抗体结合等复杂步骤，短时间即可实现细胞外囊泡与低密度脂蛋白差异化分选，并且可快速实现高纯度分离。

20、（4）低成本：通过渗透压物理调控原理，无需昂贵生化试剂、专用试剂盒与高端配套耗材，大幅降低样本分离与鉴别成本。

1.一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分方法，其特征在于，包括：将待测样品均分为三组；第一组待测样品加入 pbs 缓冲溶液维持正常渗透压；第二组待测样品加入超纯水，构建低渗环境；第三组待测样品加入质量分数为1.8%的氯化钠溶液，构建高渗环境；三组待测样品均静置20min 后，分别进行形貌和粒径检测；

2.如权利要求1所述的一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分方法，其特征在于，所述低渗溶液为超纯水，所述高渗溶液为1.8%氯化钠溶液。

3.如权利要求2所述的一种关于小细胞外囊泡与低密度脂蛋白的区分方法，其特征在于，当检测所述待测样品在不同渗透压下的形貌与粒径无变化时，判断所述待测样品为低密度脂蛋白；当检测所述待测样品在低渗透压下发生膨胀，粒径增大，并且所述待测样品在高渗透压下发生皱缩，粒径减小，判断所述待测样品为小细胞外囊泡。

4.一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于， 包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述步骤一中，所述低渗溶液为超纯水。

6.如权利要求4所述的一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述步骤一中，静置60min。

7.如权利要求4所述的一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述步骤一中，使用无菌0.1μm滤膜过滤。

8.如权利要求4所述的一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述步骤二中，所述高渗溶液为1.8%氯化钠溶液。

9.如权利要求4所述的一种低密度脂蛋白的分离方法，其特征在于，所述步骤三中，所述差速超速离心法具体为：调整渗透压后的溶液于4℃、10000×g离心60min，收集上清液，再于4℃、250000×g离心70min。