一种SpeciosinP衍生物关键手性中间体的合成方法与流程

本发明涉及生物工程，特别涉及一种speciosin p衍生物关键手性中间体的合成方法。

背景技术：

1、speciosin p是一种天然含氧环己烷类化合物，最早从担子菌

hexagonia

speciosa的发酵培养物中分离得到。其分子结构以氢醌母核连接一个炔基侧链为特征，化学名为2-(3,4-二羟基丁-1-炔基)苯-1,4-二醇。近年来，该化合物因其独特的结构特征和潜在的生物活性而受到关注。speciosin p的生物学活性主要体现在植物生长调控领域。在小麦胚芽鞘生物测定中，该化合物表现出显著的化感活性，ic50值达到14 µm，而其低活性类似物speciosin g的ic50仅为2568 µm。研究表明，侧链末端羟基对强效植物毒性活性至关重要，这使得speciosin p成为构效关系（sar）研究和植物生长调节剂发现中的理想参考标准。此外，speciosin p及其类似物还展现出潜在的医药应用前景，包括抗菌和抗癌活性。相关研究发现，speciosins g和p对人类癌细胞系hela和ht29具有细胞毒活性，并能抑制酿酒酵母的线粒体呼吸。这些发现提示speciosin p在药物或农药开发中具有潜在价值。

2、speciosin p的首个全合成路线由guerrero-vásquez等于2014年报道。该合成策略的核心是sonogashira偶联反应，从易得的商业原料出发构建目标分子的核心骨架。此外，从同一原料出发还可以在两步内合成相关天然产物siccayne。合成过程中涉及卤代二醇中间体的制备，并通过环氧化和区域选择性转化等步骤得到最终产物。然而，化学合成法也存在局限：多步反应涉及有机溶剂和金属催化剂的使用，环境友好性较差；对于大规模生产而言，成本可能较高；此外，化学合成得到的是外消旋体，而天然产物可能具有特定的光学活性。

3、因此，为进一步丰富speciosin p化合物的分子多样性、优化药理活性，研究人员常对speciosin p进行结构修饰，制备得到系列speciosin p衍生物。直接以speciosin p为底物进行化学修饰往往位点选择性难以控制，因此，speciosin p衍生物的合成通常需要先获得对应的关键中间体，该类中间体是构建speciosin p衍生物的重要前体，在天然产物衍生化研究中具有较高的研究价值。其中，speciosin p衍生物的化学结构如图1所示。

4、目前，针对该speciosin p衍生物的中间体的制备主要依赖化学合成路线，已见报道的生物合成方法较少。现有化学合成工艺普遍存在反应条件苛刻、立体选择性差、副产物较多的问题，造成产物分离难度大、制备成本高，难以满足研究及规模化制备的需求。因此，开发一种针对speciosin p衍生物中间体的合成方法具有重要的研究意义与应用价值。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种speciosin p衍生物关键手性中间体的合成方法。具体提供了一种酯酶催化外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇合成手性中间体(2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇，该手性醇为speciosin p衍生物的中间体。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

3、本发明的第一个方面，提供了氨基酸序列如seq id no：1所示的脂肪酶在制备(2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇中的应用。

4、在本发明的一些实施方式中，所述(2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇通过脂肪酶催化外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇进行对映体选择性转酯反应制备。

5、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的反应体系还包括辅料。

6、在本发明的一些实施方式中，所述辅料为酯类化合物。

7、在本发明的一些实施方式中，所述酯类化合物包括乙酸乙烯酯。

8、在本发明的一些实施方式中，所述辅料的加入量为外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇的1-3倍摩尔当量。

9、在本发明的一些实施方式中，所述辅料的加入量为外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇的2倍摩尔当量。

10、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应在有机溶剂中进行。

11、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲叔醚、甲苯、石油醚、dmso和环己烷中的至少一种。

12、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲叔醚、甲苯和石油醚中的至少一种。

13、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂具体为甲叔醚。

14、在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶以游离酶或固定化酶的形式使用。

15、在本发明的一些实施方式中，所述游离酶以发酵上清、粗酶液或纯化酶的形式进行催化。

16、在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶以固定化酶的形式用于所述选择性转酯反应。

17、在本发明的一些实施方式中，所述固定化酶包括脂肪酶和固定化载体。

18、在本发明的一些实施方式中，所述固定化载体包括氨基树脂、环氧树脂和大孔吸附树脂中的至少一种。

19、在本发明的一些实施方式中，所述氨基树脂选自lxte-703、esr-3、es110、ha104f、ea104f、ha109m、lxte-701、lxte-704和lxte-700s中的至少一种。

20、在本发明的一些实施方式中，所述环氧树脂选自es108、es103b、ga611m和lxte-1000hfa中的至少一种。

21、在本发明的一些实施方式中，所述大孔吸附树脂包括esq-3。

22、在本发明的一些实施方式中，所述固定化载体为环氧树脂。

23、在本发明的一些实施方式中，所述固定化载体具体为lxte-1000hfa。

24、在本发明的一些实施方式中，所述固定化酶的制备方法包括：将所述脂肪酶与经预处理的固定化载体在缓冲液中接触，使所述脂肪酶固定于所述固定化载体上。

25、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

26、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液为0.1 m、ph 8.0的磷酸钠缓冲液。

27、在本发明的一些实施方式中，所述固定化的温度为25-35℃，固定化时间为15-21h。

28、在本发明的一些实施方式中，所述固定化的温度为30℃，固定化时间为18 h。

29、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的温度为20-35℃。

30、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的温度为25℃。

31、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的反应时间为16-20 h。

32、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的反应时间为18 h。

33、在本发明的一些实施方式中，当采用固定化酶作为催化剂时，所述外消旋3-炔-1,2-二醇与固定化酶的质量比为1:1至5:1。

34、在本发明的一些实施方式中，当采用固定化酶作为催化剂时，所述外消旋3-炔-1,2-二醇与固定化酶的质量比为2:1。

35、在本发明的一些实施方式中，每2.0 g外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇加入1.0 g所述固定化酶。

36、在本发明的一些实施方式中，每2.0 g外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇采用15-25ml有机溶剂进行溶解。

37、在本发明的一些实施方式中，每2.0 g外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇采用20 ml有机溶剂进行溶解。

38、在本发明的一些实施方式中，每2.0 g外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇对应加入20 ml有机溶剂、1.0 g固定化酶和2倍摩尔当量的辅料。

39、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应结束后，对反应产物进行分离，获得（2r）-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇。

40、在本发明的一些实施方式中，采用高效液相色谱法对反应体系中的底物和产物进行检测，并根据底物和产物的检测结果计算反应转化率以及产物的对映体过量值（ee值）。

41、本发明的第二个方面，提供了一种制备(2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇的方法，包括如下步骤：采用氨基酸序列如seq id no：1所示的脂肪酶催化外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇进行对映体选择性转酯反应，得到(2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇。

42、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应在辅料和有机溶剂的存在下进行。

43、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲叔醚、甲苯、石油醚、dmso和环己烷中的至少一种。

44、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂包括甲叔醚、甲苯和石油醚中的至少一种。

45、在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂具体为甲叔醚。

46、在本发明的一些实施方式中，所述辅料为酯类化合物。

47、在本发明的一些实施方式中，所述酯类化合物包括乙酸乙烯酯。

48、在本发明的一些实施方式中，所述辅料的加入量为外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇的1-3倍摩尔当量。

49、在本发明的一些实施方式中，所述辅料的加入量为外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇的2倍摩尔当量。

50、在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶以游离酶或固定化酶的形式使用。

51、在本发明的一些实施方式中，所述脂肪酶的具体使用形式如上述方面所述。

52、在本发明的一些实施方式中，所述选择性转酯反应的温度和反应时间如上述方面所述。

53、本发明的有益效果是：

54、本发明首次通过优选酶的生物催化外消旋2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇合成（2r)-2-甲基丁-3-炔-1,2-二醇，该生物催化法不仅反应条件温和、对环境友好，具有高度的区域选择性和立体选择性，而且避免了手性拆分和产物中重金属残留，恰好弥补了化学方法的不足之处。同时，对于本发明提供的优选脂肪酶lip-1，其催化上述反应的收率达45%(理论收率50%)，产生光学纯度可达99.2%，纯度为99.5%，具有立体选择性强、拆分效率高、产物纯度高的技术优势；同时该合成方法仅需一步反应即可获得目标产物，且具有反应简单、步骤少、反应条件温和、对环境友好、催化活性较高、生产成本低等优点，具有较大的工业应用潜力和商业价值。