一种比活力与热稳定性双重提升的碱性蛋白酶突变体及其应用

本发明属于基因工程和蛋白质工程，具体涉及一种比活力与热稳定性双重提升的碱性蛋白酶突变体、工程菌及其应用。

背景技术：

1、蛋白酶是一种温和的高效催化剂，它不仅能够催化蛋白质肽键的水解，还可用于多肽和酯基的合成，也是工业上应用最广的一类酶。碱性蛋白酶是指在碱性条件下具有高效催化蛋白质水解活性的酶类，同时也是蛋白酶家族中最重要的一类蛋白酶，它能够在极端的碱性环境（ph 9.0-11.0）下保持高水解活性。蛋白酶的主要来源有动物、植物和微生物。目前市场上可用的蛋白酶主要来源于细菌、真菌及放线菌等微生物体内，因为它们产量高、资源消耗少、基因可编辑性高，易实现规模化发酵，成为工业蛋白酶的主要来源。成为洗涤剂、食品加工、皮革脱毛、医药中间体等领域的核心酶制剂。

2、芽孢杆菌属来源的碱性蛋白酶因催化效率高、底物特异性广等特点，成为工业领域中碱性蛋白酶的主要生产菌株。尤以克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶突出，其能在高酸、高盐极端环境下保持生物活性，分泌的碱性蛋白酶具备一定的环境耐受性，应用潜力显著。但现有克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶的最适作用温度集中在中温区间，而洗涤、食品、饲料等行业的工业化生产中，为提升生产效率、缩短反应周期，常需要在较高温度下进行酶解反应，中温型碱性蛋白酶在高温条件下易发生空间结构变性失活，酶活力和稳定性大幅下降，极大地限制了其应用范围。

技术实现思路

1、针对现有技术不足，本发明基于祖先序列重建技术对克劳氏芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶进行定向改造，目的是提供一种高温下比活力和热稳定性双重提升的突变体，解决碱性蛋白酶工业化应用的温度限制问题。

2、本发明技术方案概述如下：

3、本发明提供一种碱性蛋白酶突变体，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

4、本发明还提供所述碱性蛋白酶突变体的编码基因。

5、本发明还提供包含所述编码基因的载体、重组载体或表达载体。

6、本发明还提供包含所述编码基因或重组载体的宿主细胞。

7、本发明还提供制备所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。

8、本发明还提供所述碱性蛋白酶突变体在食品制造、洗涤剂制造或皮革工业中的应用。

9、本发明所述碱性蛋白酶突变体相比野生型蛋白酶具有提高的比活力和/或热稳定性。

10、本发明有益效果如下：

11、本发明公开了一种比活力与热稳定性双重提升的碱性蛋白酶突变体及其基因工程菌与应用。以克劳氏芽孢杆菌（

bacillus clausii）来源的野生型碱性蛋白酶apre为模板，经同源序列比对、进化分析及祖先序列重建技术获得突变基因，构建工程菌并进行发酵，对发酵上清液进行蛋白纯化后，获得碱性蛋白酶突变体ap-391酶液。对纯化后野生型apre和突变体ap-391进行比活力与温度稳定性测试。测试结果表明，突变体ap-391的比活力较野生型提高了16.9%，同时在60℃、ph 10.5条件下，保温24 h后，突变体ap-391的残余酶活力较野生型提高了233.6%，其热稳定性显著提升。

12、祖先序列重建技术作为酶定向改造的理性设计策略，可通过解析蛋白进化历程筛选关键功能位点，相较于传统随机突变，具有突变靶点明确、筛选效率高、改造效果可控的优势。

1.一种碱性蛋白酶突变体，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

2.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述编码基因，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因或权利要求4所述重组载体。

6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主是解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

7.一种制备权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或包含编码基因的表达载体进行基因重组和表达。

8.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体在食品制造中作为食品工业用酶制剂的应用。

9.一种洗涤剂组合物，其包括：作为活性成分的权利要求1所述碱性蛋白酶突变体，以及洗涤剂中常规可接受的表面活性剂或基质载体。

10.一种皮革处理制剂，其包括：权利要求1所述碱性蛋白酶突变体，以及皮革加工中可接受的工业载体或赋形剂。