唾液酸光学探针及其制备方法和应用

本发明涉及光学探针，尤其涉及一种唾液酸光学探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、唾液酸(sialic acid)是人体生理活动中至关重要的糖类化合物，广泛参与细胞识别、免疫调节及神经发育等关键生物过程。作为糖蛋白和糖脂的重要组成成分，唾液酸通过其独特的羧基结构在细胞膜表面形成负电荷屏障，调控细胞间相互作用与信号传递。尤其在神经系统中，唾液酸对突触可塑性和脑功能发育具有不可替代的作用，其代谢异常与多种神经系统疾病密切相关。

2、唾液酸的代谢网络复杂且高度组织特异性。在肝脏和肾脏中，唾液酸主要通过n-乙酰神经氨酸醛缩酶(npl)途径进行分解代谢，生成n-乙酰甘露糖胺和丙酮酸，后者进入三羧酸循环供能。而在脑组织中，唾液酸更多地通过糖基化途径整合到神经节苷脂中，参与髓鞘形成和神经递质运输。近期研究发现，唾液酸还可作为前体物质通过cmp-唾液酸合成酶(cmas)途径循环利用，这一过程对维持黏膜免疫屏障功能至关重要。值得注意的是，唾液酸代谢与炎症反应存在双向调控：一方面，炎性因子tnf-α可上调唾液酸转移酶表达；另一方面，唾液酸化修饰能够通过抑制补体激活调节免疫应答。

3、临床研究表明，唾液酸代谢紊乱与多种病理状态相关。先天性唾液酸贮积症因溶酶体唾液酸酶缺陷导致唾液酸在组织中异常累积，引发智力障碍和骨骼畸形。而在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表面唾液酸过度表达形成"唾液酸屏障"，通过抑制nk细胞活性实现免疫逃逸。阿尔茨海默病患者脑脊液中游离唾液酸水平显著升高，其糖基化模式改变可能影响β-淀粉样蛋白清除效率。更值得关注的是，某些病原体如流感病毒通过劫持宿主唾液酸受体实现感染，这一机制为抗病毒药物开发提供了新靶点。

4、目前最常用的检测唾液酸的方法有高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法(fangm等.biomedical chromatography,2020,34(2),145-147)和酶联免疫吸附法(wu l等.foodchemistry,2024,461(31),1455-1458)等。高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法可以高效并精准地测定样品中唾液酸的含量变化，但其中涉及细胞内代谢物的提取，实验步骤繁琐且周期较长。酶联免疫吸附法不能实时监控活细胞内唾液酸的变化，因此亟需开发出能够原位监测活细胞内唾液酸动态变化的遗传编码荧光探针。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测唾液酸的探针和方法。

2、本发明提供一种唾液酸结合蛋白变体，其

3、(a)具有seq id no:1所示的序列或其截去第1-96位氨基酸的功能片段并且在以下一个或多个位点具有突变：s115、h116、n164、q208、a209、n214、s217、q220，所述位点编号按照seq id no:1序列，

4、(b)与(a)的序列具有至少70％序列相同性并具有(a)所述突变并保留对唾液酸结合能力的序列。

5、在一个或多个实施方案中，所述突变位点选自以下任一组：(1)s115和h116，(2)q208和a209；(3)q208、a209和n164，(4)q208、a209和n214，(5)q208、a209和s217，(6)q208、a209和q220。

6、在一个或多个实施方案中，s115突变为e、l、a、v、r、g或w。

7、在一个或多个实施方案中，h116突变为a、d、f、g、h、v或w。

8、在一个或多个实施方案中，n164突变为i。

9、在一个或多个实施方案中，q208突变为r、v或k。

10、在一个或多个实施方案中，a209突变为t、v或s。

11、在一个或多个实施方案中，n214突变为h。

12、在一个或多个实施方案中，s217突变为t。

13、在一个或多个实施方案中，q220突变为d、e、g、n或s。

14、在一个或多个实施方案中，所述突变选自以下任一组：(1)s115e和h116f，(2)s115l和h116g，(3)s115a和h116f，(4)s115v和h116l，(5)s115r和h116f，(6)s115e和h116w，(7)s115a和h116a，(8)s115g和h116h，(9)s115g和h116l，(10)s115w和h116v，(11)s115a和h116d，(12)q208r和a209t，(13)q208v和a209v，(14)q208k和a209s，(15)q208r、a209t和n164i，(16)q208r、a209t和n214h，(17)q208r、a209t和s217t，(18)q208r、a209t和q220d，(19)q208r、a209t和q220e，(20)q208r、a209t和q220g，(21)q208r、a209t和q220n，(22)q208r、a209t和q220s。

15、本发明提供一种唾液酸光学探针，包含唾液酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于唾液酸敏感多肽的序列内。唾液酸敏感多肽被光学活性多肽或其功能变体分为第一部分和第二部分。

16、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸光学探针，包括唾液酸敏感多肽b和光学活性多肽a，其中光学活性多肽a位于唾液酸敏感多肽b的序列内，将唾液酸敏感多肽b分为第一部分b1和第二部分b2，形成b1-a-b2式的探针结构。

17、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸敏感多肽包括唾液酸结合蛋白或其功能片段。

18、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸敏感多肽源自痢疾志贺氏菌shigelladysenteriae。

19、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸敏感多肽是唾液酸结合蛋白nanr。

20、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列或其截去第1-96位氨基酸后的功能片段，或与其有至少70％序列相同性并保留唾液酸结合活性的序列。

21、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸敏感多肽是本文任一实施方案所述的唾液酸结合蛋白变体。

22、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体，其中，荧光蛋白的功能变体在与光学活性多肽连接处的3个氨基酸内具有突变。

23、在一个或多个实施方案中，所述荧光蛋白选自黄色荧光蛋白(如seq id no:2所示的cpyfp)、橘黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白(如seq id no:3所示的cpgfp)、蓝色荧光蛋白(如seq id no:4所示的cpbfp)、或苹果红荧光蛋白(如seq id no:5所示的cpmapple)。优选地，所述荧光蛋白是cpyfp。

24、在一个或多个实施方案中，所述荧光蛋白的功能变体在如seq id no:2所示的序列的第1-3位或244-246位的氨基酸处具有突变，优选地，在第1位或第246位的氨基酸处具有突变。

25、在一个或多个实施方案中，所述荧光蛋白的功能变体在如seq id no:2所示序列的第1位的氨基酸突变为v、i、s、h或c，和/或，第246位的氨基酸突变为s或c。

26、在一个或多个实施方案中，所述荧光蛋白的功能变体的突变选自以下任一组：(1)y1v，(2)y1i，(3)y1s，(4)y1h，(5)y1c，(6)n246s，(7)n246c。

27、在一个或多个实施方案中，所述光学探针还包含或不包含侧接所述光学活性多肽的一个或多个接头。

28、在一个或多个实施方案中，所述接头可以是任何长度的任何氨基酸序列。

29、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽侧翼包含不超过5个氨基酸的接头。

30、在一个或多个实施方案中，光学活性多肽侧翼的接头包含氨基酸y。

31、在一个或多个实施方案中，接头y位于光学活性多肽的n端和/或c端。

32、在一个或多个实施方案中，光学探针如下所示：唾液酸敏感多肽的第一部分b1、y、光学活性多肽a、唾液酸敏感多肽的第二部分b2。

33、在一个或多个实施方案中，本发明光学探针还包含定位序列，用于将探针定位到例如细胞的特定细胞器。

34、在一个或多个实施方案中，本发明提供的光学探针包含唾液酸敏感多肽和光学活性多肽，并且所述光学活性多肽位于唾液酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：113/114、113/115、113/116、113/117、113/118、113/119、113/120、113/121、113/122、114/114、114/115、114/116、114/117、114/118、114/119、114/120、114/121、114/122、115/114、115/115、115/116、115/117、115/118、115/119、115/120、115/121、115/122、116/114、116/116、116/118、116/120、116/122、116/124、116/126、116/128、116/130、117/114、117/115、117/116、117/117、117/118、117/119、117/120、117/121、117/122、118/114、118/115、118/116、118/117、118/118、118/119、118/120、118/121、118/122、119/114、119/115、119/116、119/117、119/118、119/119、119/120、119/121、119/122、120/114、120/115、120/116、120/117、120/118、120/119、120/120、120/121、120/122、139/140、139/141、139/142、139/143、139/144、139/145、140/141、140/142、140/143、140/144、140/145、141/142、141/143、141/144、141/145、142/143、142/144、142/145、143/144、143/145、144/145、159/160、159/161、159/162、159/163、159/164、159/165、160/161、160/162、160/163、160/164、160/165、161/162、161/163、161/164、161/165、162/163、162/164、162/165、163/164、163/165、164/165、178/179、178/180、178/181、178/182、178/183、178/184、178/185、178/186、179/180、179/181、179/182、179/183、179/184、179/185、179/186、180/181、180/182、180/183、180/184、180/185、180/186、181/182、181/183、181/184、181/185、181/186、182/183、182/184、182/185、182/186、183/184、183/185、183/186、184/185、184/186、185/186、200/201、200/202、200/203、200/204、200/205、200/206、200/207、200/208、200/209、200/210、200/211、200/212、201/201、201/202、201/203、201/204、201/205、201/206、201/207、201/208、201/209、201/210、201/211、201/212、202/201、202/202、202/203、202/204、202/205、202/206、202/207、202/208、202/209、202/210、202/211、202/212、203/201、203/202、203/203、203/204、203/205、203/206、203/207、203/208、203/209、203/210、203/211、203/212、204/201、204/202、204/203、204/204、204/205、204/206、204/207、204/208、204/209、204/210、204/211、204/212、205/201、205/202、205/203、205/204、205/205、205/206、205/207、205/208、205/209、205/210、205/211、205/212、206/201、206/202、206/203、206/204、206/205、206/206、206/207、206/208、206/209、206/210、206/211、206/212、207/201、207/202、207/203、207/204、207/205、207/206、207/207、207/208、207/209、207/210、207/211、207/212、208/201、208/202、208/203、208/204、208/205、208/206、208/207、208/208、208/209、208/210、208/211、208/212、209/201、209/202、209/203、209/204、209/205、209/206、209/207、209/208、209/209、209/210、209/211、209/212、210/201、210/202、210/203、210/204、210/205、210/206、210/207、210/208、210/209、210/210、210/211、210/212、211/201、211/202、211/203、211/204、211/205、211/206、211/207、211/208、211/209、211/210、211/211、211/212、228/229、228/230、228/231、228/232、228/233、228/234、229/230、229/231、229/232、229/233、229/234、230/231、230/232、230/233、230/234、231/232、231/233、231/234、232/233、232/234和/或233/234。在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽位于唾液酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：115/117、116/116、117/116、120/117、205/202、120/121、120/118、207/207、211/208、211/209、206/210、206/211、208/210、209/210、208/206、208/207、211/207、209/209、210/209、209/208、206/208、206/211、121/120、208/208、205/203、114/120、115/119、115/122、116/121、118/116、203/205、205/210、207/210、119/121、200/201、206/204、208/204、208/205、211/205、210/206、210/207、114/118、115/116、205/212、118/114、115/115、209/202、210/202。

35、在一个或多个这些实施方案中，所述唾液酸敏感多肽具有：(i)seq id no:1所示的序列或其截去第1-96位氨基酸后的功能片段，或与其有至少70％序列相同性并保留对唾液酸结合活性的序列，(ii)本文任一实施方案所述的唾液酸结合蛋白变体的序列，或(iii)与(ii)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(ii)所述突变并保留对唾液酸敏感性的序列。

36、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽具有：(a)seq id no:2-5中任一所示的序列，(b)seq id no:2所示的序列并且在y1和/或n246具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述突变选自以下任一组：(1)y1v，(2)y1i，(3)y1s，(4)y1h，(5)y1c，(6)n246s，(7)n246c，或(c)与(a)或(b)有至少70％序列相同性并保留荧光蛋白功能的变体序列。

37、在一个或多个实施方案中，所述唾液酸光学探针序列如seq id no:8-13所示。

38、本发明还提供一种融合多肽，包含本文所述唾液酸光学探针和其它多肽。

39、在一个或多个实施方案中，其他多肽位于所述光学探针的n端和/或c端。

40、在一个或多个实施方式中，其他多肽包括定位序列)、便于纯化的标签或者用于免疫反应)的标签。

41、在一个或多个实施方案中，所述定位序列包括但不限于将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽。

42、在一个或多个实施方案中，所述免疫反应包括但不限于免疫印迹。

43、在一个或多个实施方案中，所述融合多肽中的光学探针和其它多肽之间具有/或不具有接头。

44、本发明还提供一种分离的多核苷酸，其包含：

45、(a)编码本文任一实施方案所述的唾液酸结合蛋白变体、唾液酸光学探针、融合多肽的核苷酸序列或其互补序列，

46、(b)与(a)所示序列有至少80％(较佳地至少90％)相同性的核苷酸序列或其互补序列，或

47、(c)(a)或(b)的引物片段。

48、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包括上述核酸序列的的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。

49、本发明还提供一种核酸构建物，其包含本文所述的多核苷酸。

50、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

51、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸与表达控制序列操作性连接。

52、在一个或多个实施方案中，所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和/或病毒载体。

53、本发明还提供一种工程化的宿主细胞，所述细胞：

54、(1)包含、表达或分泌本文任一实施方案所述的唾液酸光学探针、融合多肽或其变体，

55、(2)含有本文所述的多核苷酸，或

56、(3)含有本文所述的核酸构建物。

57、在一个或多个实施方案中，宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

58、本发明还提供本文任一实施方案所述的唾液酸光学探针的用途，用于唾液酸的细胞内和/或细胞外定位。

59、在一个或多个实施方案中，所述用途为：将本文任一实施方案所述唾液酸光学探针、融合多肽、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞与体系接触，检测光学活性多肽的变化。

60、在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。

61、本发明还提供一种唾液酸的细胞内和/或细胞外定位的方法，所述方法为：将本文任一实施方案所述唾液酸光学探针、融合多肽、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞与体系接触，检测光学活性多肽的变化。

62、在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。

63、本发明还提供一种本文所述唾液酸光学探针的制备方法，包括步骤：

64、1)提供本文任一实施方案所述的宿主细胞；

65、2)在适合的条件下培养所述宿主细胞，

66、3)分离唾液酸光学探针。

67、在一个或多个实施方案中，制备本文所述唾液酸光学探针或融合多肽的方法包括以下步骤：1)将编码本文所述唾液酸光学探针的表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离唾液酸光学探针。

68、本发明还提供一种唾液酸的定量检测方法，包括步骤：使本文所述光学探针或融合多肽与样品接触，和检测光学活性多肽的变化。

69、在一个或多个实施方案中，所述检测在体内、体外、亚细胞或原位进行。

70、在一个或多个实施方案中，所述样品是血液。

71、本发明还提供一种根据光学活性多肽的变化筛选化合物的方法，包括步骤：使本文任一实施方案所述唾液酸光学探针、融合多肽、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞与候选化合物接触，检测光学活性多肽的变化。

72、在一个或多个实施方案中，所述方法可以高通量筛选化合物。

73、在一个或多个实施方案中，在含唾液酸的体系中使本文所述宿主细胞与候选化合物接触，并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否能调节细胞对唾液酸的摄取。

74、在一个或多个实施方案中，所述体系是溶液体系、细胞体系、亚细胞体系。

75、本发明还提供一种试剂盒，其包含本文任一实施方案所述的唾液酸光学探针、融合多肽、多核苷酸、核酸构建物或宿主细胞。

76、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂：缓冲液、培养基、唾液酸标准品。

77、本发明还提供本文所述唾液酸光学探针或融合多肽或宿主细胞在检测样品中的唾液酸、筛选化合物或唾液酸细胞内/外定位中的应用。在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。

78、本发明还提供本文所述唾液酸光学探针或融合多肽或多核苷酸或核酸构建物或宿主细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测样品中的唾液酸、筛选化合物或唾液酸的细胞内和/或细胞外定位。

79、本发明的有益效果：

80、本发明提供的唾液酸光学探针易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测唾液酸，省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本技术所提供的唾液酸光学探针对唾液酸的最高响应达到对照的12倍以上，并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测，并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中唾液酸定量检测。