乙酰木聚糖酯酶突变体及其应用

本发明属于酶工程，具体涉及乙酰木聚糖酯酶突变体及其应用。

背景技术：

1、半纤维素是一类丰富可再生而又亟待开发和利用的生物质资源，可将半纤维素降解为糖类进而生产木糖醇及其它化学品来进行利用，这对解决能源危机、温室效应等一系列全球问题有很大的促进作用。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的重要组成成分，约占植物细胞干重的15％-35％。其分子结构复杂，木糖聚合物中广泛连接乙酰基、阿拉伯糖基、阿魏酸和4-o-甲基-d-葡萄糖醛酸残基等基团，形成不同的侧链基团。其中，乙酰基团的存在对木聚糖酶降解木聚糖会产生阻碍作用，导致底物水解效率降低，产生空间障碍，限制了主链降解酶和主链的接触，降低了酶对底物的可及性。

2、而乙酰木聚糖酯酶可特异性地消除乙酰化木聚糖中木糖残基c-2和c-3位的o-乙酰取代基，从而提高木聚糖酶对主链的可及性，改善细胞壁中木聚糖酶的水解效率，对于实现木聚糖的高效降解具有重要意义，是目前了解最少的植物细胞壁降解酶系之一。

3、目前，乙酰木聚糖酯酶被主要应用在降解木聚糖和制备低聚木糖方向。虽然工业上常应用酸碱法进行降解，但是酸碱法在作用木聚糖之后产生的许多物质，对微生物的后期发酵具有负面效应，同时在反应过程中会不断生成酸碱废液而对环境造成污染。生物酶法相比于化学法更为绿色环保，且高效专一，提高了产物中寡糖的产量，具备诸多优势。除此之外，乙酰木聚糖酯酶作为木聚糖酶系的“成员”，还能与纤维素酶、半纤维素酶等协同降解部分聚酯类化合物的侧链乙酰基，在纺织、造纸回收、化妆品、烘焙等行业中应用前景广泛。但是，现有的乙酰木聚糖酯酶存在热稳定性差、活性受大部分金属离子和有机试剂抑制、对pnpb和pnpo的催化活性等缺陷，这限制了乙酰木聚糖酯酶突变体的应用。因此，需要开发稳定性高、活性高的乙酰木聚糖酯酶突变体。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了乙酰木聚糖酯酶突变体及其应用；本发明对乙酰木聚糖酶ace为模版进行理性设计，通过将第其243位或260位的氨基酸突变，得到两种改变模版蛋白酶学性质的突变体，然后通过构建质粒、转化培养、诱导表达及分离纯化等步骤，获得具有生物活性的乙酰木聚糖酯酶突变体；所述乙酰木聚糖酯酶突变体表现出更高的活性，其对pnpa，pnpb，pnpo的活性分别提高了52.2％，49.3％和44.9％；所述乙酰木聚糖酯酶突变体可用于降解木聚糖和制备低聚木糖，能够提高产物中寡糖的产量，在工业、农业及食品业具有广阔的应用前景。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：

3、本发明首先提供了乙酰木聚糖酯酶突变体，所述乙酰木聚糖酯酶突变体在氨基酸序列seq id no.1所示的乙酰木聚糖酯酶ace的基础上，将第243位和/或第260位的氨基酸突变得到。

4、优选地，将第243位的丙氨酸突变为天冬氨酸，将第260位的亮氨酸突变为精氨酸。

5、优选地，所述乙酰木聚糖酯酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.4所示。

6、本发明还提供了编码上述乙酰木聚糖酯酶突变体的多核苷酸。

7、优选地，所述多核苷酸如seq id no.5或seq id no.6所示。

8、本发明还提供了包含上述多核苷酸的重组表达载体。

9、优选地，所述重组表达载体的表达载体包括pet28a。

10、优选地，本发明还提供了包含上述多核苷酸、或上述重组表达载体的重组菌。

11、其中，所述重组菌的构建方法包括：

12、(1)对pet28a质粒进行线性化处理，获取线性化的pet28a质粒；

13、(2)运用无缝克隆技术，将上述编码乙酰木聚糖酯酶突变体的多核苷酸与线性化的pet28a质粒进行连接，得到重组表达载体

14、(3)将重组载体转到宿主菌bl21(de3)中形成重组菌。

15、本发明还提供了一种生产乙酰木聚糖酯酶突变体的方法，所述方法包括：

16、对所述重组菌进行培养、诱导表达、分离纯化，最终得到所述突变体基因编码的乙酰木聚糖酯酶。

17、本发明还提供了上述乙酰木聚糖酯酶突变体、或上述方法生产的乙酰木聚糖酯酶突变体在纺织、造纸回收、化妆品、烘焙等行业中的应用。

18、优选地，所述应用包括降解木聚糖和/或制备低聚木糖。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

20、本发明对来源于halalkalibacterium haloduran的乙酰木聚糖酶ace进行理性设计，获得了两种可以改变模版蛋白酶学性质的突变体。将两种突变体纯化处理后，获得了具有生物活性的蛋白产品，记为乙酰木聚糖酯酶突变体a243d和l260r。

21、本发明对乙酰木聚糖酯酶突变体a243d和l260r进行酶学性质表征，结果表明，突变体l260r表现出更高的活性，与野生型ace相比，突变体l260r对pnpa，pnpb，pnpo的活性分别提高了52.2％，49.3％和44.9％；可以更为高效的降解木聚糖。

22、本发明所述乙酰木聚糖酯酶突变体l260r在降解木聚糖和制备低聚木糖方向具有很好的应用，相比于化学法更为绿色环保，且高效专一，提高了产物中寡糖的产量，在工业、农业及食品业具有广阔的应用前景。

1.乙酰木聚糖酯酶突变体，其特征在于，所述乙酰木聚糖酯酶突变体在氨基酸序列seqid no.1所示的乙酰木聚糖酯酶ace的基础上，将第243位和/或第260位的氨基酸突变得到。

2.根据权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶突变体，其特征在于，将第243位的丙氨酸突变为天冬氨酸，将第260位的亮氨酸突变为精氨酸。

3.根据权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶突变体，其特征在于，所述乙酰木聚糖酯酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.4所示。

4.编码权利要求1所述乙酰木聚糖酯酶突变体的多核苷酸。

5.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括seq id no.5或seqid no.6、或其简并序列。

6.包含权利要求4所述多核苷酸的重组表达载体。

7.包含权利要求4所述多核苷酸、或权利要求6所述重组表达载体的重组菌。

8.一种生产乙酰木聚糖酯酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括：

9.权利要求1所述乙酰木聚糖酯酶突变体、或权利要求8所述方法生产的乙酰木聚糖酯酶突变体在纺织、造纸回收、化妆品、烘焙等行业中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括降解木聚糖和/或制备低聚木糖。