核酸内切酶Gs12-7AI1.1及其在核酸检测中的应用的制作方法

本发明属于核酸酶，具体涉及核酸内切酶gs12-7ai1.1及其在核酸检测中的应用。

背景技术：

1、核酸内切酶gs12-7是一种通过生物信息学和实验策略从宏基因组中发掘的，其在基因编辑、分子诊断和治疗等领域具有重要应用(cn116144631a)。然而，现有野生型gs12-7核酸内切酶在高温条件下容易失去活性，这限制了其在某些需要高温反应的场景(如lamp扩增或体外诊断)中的应用。此外，crispr系统介导的核酸检测技术的快速发展对高效、耐热稳定和单管法核酸检测技术提出了更高需求。

2、同时，传统的核酸检测方法，如定量pcr、微流控芯片等技术通常需要依赖于复杂的仪器设备，存在效率低、成本高等问题。因此，亟需开发一种耐热性强、功能稳定且易于工业化生产的gs12-7核酸内切酶突变体，以及结合lamp实现“单管法”核酸检测，这是当前crispr系统介导的核酸现场快速检测研究领域的重要方向。

技术实现思路

1、本发明旨在通过基于proteinmpnn深度学习算法对野生型gs12-7核酸内切酶进行工程化改造，获得一种耐热性强、功能稳定且特异性的核酸内切酶gs12-7ai1.1，并提供其在单管法核酸检测中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、gs12-7核酸内切酶突变体，包括以下蛋白：

4、ⅰ.seq id no.1所示氨基酸序列的gs12-7ai1.1蛋白；

5、ⅱ.与seq id no.1所示的氨基酸序列相比，具有80％以上序列同一性的蛋白，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。

6、融合蛋白，包含上述蛋白和其他修饰部分。

7、编码gs12-7核酸内切酶突变体的多核苷酸。

8、上述gs12-7核酸内切酶突变体，或融合蛋白，或多核苷酸，或载体在核酸检测中的应用。

9、一种可视化核酸检测试剂盒，包括gs12-7核酸内切酶突变体，单链dna荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导rna。

10、可视化检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒，包括lamp引物，gs12-7核酸内切酶突变体，单链dna荧光-淬灭报告基因以及与靶标核酸配对的向导rna，所述lamp引物如seq idno.5-10所示，所述向导rna序列如seq id no.11所示。优选地，所述单链dna荧光-淬灭报告基因的序列如seq id no.12所示。

11、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

12、1.gs12-7ai1.1突变体较gs12-7能在55℃高温条件下反应时间更持久，具有显著的耐热稳定性，适用于与lamp扩增结合进行单管检测靶标核酸分子。

13、2.gs12-7ai1.1识别的pam基序偏好胞嘧啶(c)，能检测野生型gs12-7难以识别的靶标。

1.gs12-7核酸内切酶突变体，其特征在于，包括以下蛋白：

2.融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述蛋白和其他修饰部分。

3.多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述核酸内切酶突变体的多核苷酸，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸。

4.载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸。

5.权利要求1所述的核酸内切酶突变体，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体在核酸检测中的应用。

6.一种可视化核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸内切酶突变体，单链dna荧光-淬灭报告基因，与靶标核酸配对的向导rna。

7.可视化检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括lamp引物，权利要求1所述的核酸内切酶突变体，单链dna荧光-淬灭报告基因以及与靶标核酸配对的向导rna，所述lamp引物如seq id no.5-10所示，所述向导rna序列如seq id no.11所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述单链dna荧光-淬灭报告基因的序列如seq id no.12所示。