果胶裂解酶突变体及其应用

本发明属于生物工程和酶工程，具体涉及果胶裂解酶突变体及其应用。

背景技术：

1、果胶裂解酶(pectate lyase，简称pl)基于β-反式消除作用切割果胶内部的α-1,4-糖苷键以产生寡聚糖，其在食品、造纸、纺织和饲料等领域具有较大应用潜力。天然的pl广泛存在于动植物和微生物中，但动植物中pl产量低，难以提取；微生物生长快速、培养条件简单、制备相对简单，是目前pl的重要来源。目前现存的pl仍存在一些局限性，比如耐碱性和耐热性差、ph作用范围小等。申请人前期研究的碱性果胶酶基因ncbi号为alk03050.1，含有963bp的开放阅读框，编码321个氨基酸，将该基因pela在大肠杆菌bl21(de3)中进行表达所得碱性果胶裂解酶经纯化后进行酶学性质分析的研究表明，该酶的最适温度为70℃，最适ph为10.0，比酶活为108.60±0.60u/mg，可以有效地降解聚半乳糖醛酸。但是该酶热稳定性不好，在70℃ph10.0条件下t1/2值仅有40.54min，不利于工业应用，因此通过分子改造方法提高该碱性果胶裂解酶的热稳定性具有重要意义。

2、对工业酶进行分子改造的方法主要有基于非理性设计的定向进化和基于理性设计的定点突变等。定向进化通过随机突变引入氨基酸突变位点(区域)，需结合高通量筛选获得热稳定性提高的酶；定点突变则是指通过pcr等手段定点改变目的dna特定位点，包括碱基的添加、删除、点突变等，其具有突变率高、重复性好等优点，已被广泛用于酶性能的改良。

3、因此，需要通过定向突变构建热稳定性高、催化性能好的果胶裂解酶突变体。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了果胶裂解酶突变体及其应用；本发明以野生型碱性果胶裂解酶的基因为模板，采用定点突变技术对其进行突变，然后将其重组表达，获得碱性果胶裂解酶突变体；所述碱性果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seqid no.3、seq id no.5或seq id no.7所示；本发明所述碱性果胶裂解酶突变体在碱性条件下，酶活力、催化效率以及热稳定性有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，能够有效降解聚半乳糖醛酸，在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中具有很好的应用，具有很好的实用性。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术效果。

3、本发明首先提供了一种果胶裂解酶突变体，所述果胶裂解酶突变体在氨基酸序列seq id no.1所示的野生型碱性果胶裂解酶基础上，将其第82位天冬氨酸、或第154位的组氨酸、或第203位的天冬酰胺突变得到。

4、优选地，将第82位的天冬氨酸突变为甲硫氨酸，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，其采用疏水性氨基酸填充内部疏水空腔；

5、将第154位的组氨酸突变为天冬酰胺，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seqid no.5所示，实现电荷性质逆转；

6、将第203位的天冬酰胺突变为组氨酸，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seqid no.7所示，在柔性loop区引入兼具极性与疏水性的咪唑环结构，虽未形成新盐桥/氢键但优化局部微环境。

7、本发明还提供了编码上述果胶裂解酶突变体的多核苷酸。

8、优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no.4、或seq id no.6、或seq idno.8、或其中任意一条的简并序列所示。

9、本发明还提供了包含上述多核苷酸的重组表达载体。

10、优选地，所述重组表达载体的表达载体包括pet28a或其他现有的表达载体构建。

11、使用上述多核苷酸构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。所述启动子优选为t7启动子，在t7启动子的作用下，果胶裂解酶突变体可以直接在宿主细胞e.colibl21(de3)中，完成胞内的可溶性表达。

12、此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

13、优选地，本发明还提供了包含上述多核苷酸、或上述重组表达载体的重组菌。

14、优选地，所述重组菌的宿主细胞包括大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)或其他能表达果胶裂解酶突变体的菌株。

15、其中，所述重组菌的构建方法包括：

16、(1)对pet28a质粒进行线性化处理，获取线性化的pet28a质粒；

17、(2)运用无缝克隆技术，将编码上述碱性果胶裂解酶突变体的多核苷酸与线性化的pet28a质粒进行连接，得到重组表达载体

18、(3)将重组载体转到宿主菌bl21(de3)中形成重组菌。

19、本发明还提供了一种生产碱性果胶裂解酶突变体的方法，所述方法包括：

20、对所述重组菌进行培养、诱导表达、分离纯化，最终得到所述碱性果胶裂解酶突变体。

21、本发明还提供了上述果胶裂解酶突变体、或上述方法生产的果胶裂解酶突变体在降解果胶中的应用。

22、优选地，所述果胶来源包括棉麻胶质、造纸原料胶质和工业废水。

23、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

24、本发明通过定点突变的方法改造野生型碱性果胶裂解酶的基因，本发明在氨基酸序列seq id no.1所示的野生型碱性果胶裂解酶基础上，将其第82位天冬氨酸、或第154位的组氨酸、或第203位的天冬酰胺突变得到。其中，将第82位的天冬氨酸突变为甲硫氨酸，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，其采用疏水性氨基酸填充内部疏水空腔；将第154位的组氨酸突变为天冬酰胺，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seqid no.5所示，实现电荷性质逆转；将第203位的天冬酰胺突变为组氨酸，所述果胶裂解酶突变体的氨基酸序列如seq id no.7所示，在柔性loop区引入兼具极性与疏水性的咪唑环结构，虽未形成新盐桥/氢键但优化局部微环境。

25、本发明提供的果胶裂解酶突变体在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。

26、本发明通过比较野生酶和突变酶在碱性条件下对聚半乳糖醛酸的降解能力，结果表明：在ph为10.0的条件下，突变体酶d82m、h154d和n203h的催化效率(kcat/km)分别为1669.24l s-1g-1、6534.96ls-1g-1、1764.07l s-1g-1，为野生型pela的1.47、5.76、1.55倍；在70℃ph10.0条件下半衰期分别达到了60.55、57.99和57.05min，即突变体酶在碱性条件下具有耐热和高催化效率的特性，预示着其在需高温碱性条件下的工业化生产中具有重要的应用前景。