衣康酸光学探针及其制备方法和应用

本发明涉及光学探针，尤其涉及一种衣康酸光学探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、衣康酸(itaconate)是近年来备受关注的免疫代谢物，在宿主防御和炎症调控中发挥核心作用。作为三羧酸循环的重要衍生物，衣康酸主要由巨噬细胞通过免疫应答基因1(irg1)途径合成，其独特的α,β-不饱和二羧酸结构赋予其显著的亲电修饰能力。通过修饰半胱氨酸残基(即"衣康酸化")，衣康酸可激活抗氧化转录因子nrf2并抑制nlrp3炎症小体，从而双向调控氧化应激与炎症反应。此外，衣康酸通过抑制琥珀酸脱氢酶(sdh)阻断促炎性代谢物琥珀酸的积累，在脓毒症和急性肺损伤中表现出显著的保护效应。

2、衣康酸的代谢具有高度细胞类型特异性。在巨噬细胞中，irg1依赖的衣康酸合成受干扰素-γ和脂多糖(lps)等炎症信号严格调控，其产量可占细胞总代谢物的20％。而在神经细胞和内皮细胞中，衣康酸主要通过羧酸酯酶转化为衣康酸辅酶a，参与线粒体脂肪酸氧化。最新研究揭示，衣康酸还可通过甲基化生成衣康酸甲酯，增强其跨膜转运能力，并通过抑制糖酵解关键酶gapdh调节免疫代谢重编程。值得注意的是，衣康酸代谢与免疫检查点存在交互作用：其不仅能增强pd-l1表达促进肿瘤免疫逃逸，还可通过阻断iκbζ磷酸化抑制自身免疫反应。

3、临床证据表明，衣康酸代谢异常与多种疾病进程密切相关。类风湿性关节炎患者滑膜巨噬细胞中irg1表达显著上调，衣康酸通过抑制tet-dna去甲基化酶加剧关节破坏。动脉粥样硬化斑块内衣康酸水平升高可减少泡沫细胞形成，但其长期积累可能通过琥珀酸受体sucnr1促进血管钙化。在神经退行性疾病中，小胶质细胞衣康酸化修饰异常导致β-淀粉样蛋白清除障碍，而外源性衣康酸类似物di已在小鼠模型中显示改善阿尔茨海默病病理的潜力。更具挑战性的是，某些胞内病原体如沙门氏菌可劫持宿主衣康酸代谢，通过激活毒力基因抵抗巨噬细胞杀菌作用。

4、目前衣康酸检测主要依赖液相色谱-串联质谱法(lc-ms/ms)和核磁共振波谱法。尽管这些方法灵敏度高，但需破碎细胞提取代谢物，无法动态追踪活细胞内衣康酸时空分布。近期开发的衣康酸荧光探针(如基于halotag的italk探针)虽能实现亚细胞定位，但仍存在背景噪音高和响应速度慢的缺陷。因此，发展高特异性遗传编码荧光探针仍是实时解析衣康酸代谢网络的迫切需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供在细胞内、外实时定位、高通量、定量检测衣康酸的探针和方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明第一方面提供一种衣康酸结合蛋白变体，其：

4、(a)具有seq id no:1所示的序列并且在选自以下的1个、2个、3个、4个或更多个位点具有突变：s38、a50、i94、y109、t113、a114、a118、y119、a120、s126、h196、e198，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失，所述位点编号按照seq id no:1序列，

5、(b)是与(a)的序列具有至少70％序列相同性并具有(a)所述突变并保留对衣康酸结合能力的序列，

6、更优选地，所述突变包括选自以下任一组的位点处的突变：(1)t113、a114，(2)y119、a120，(3)a118、y119，(4)s38、y119、a120,(5)y109、y119、a120,(6)s126、y119、a120,(7)h196、y119、a120,(8)h196、y119、a120,(9)e198、y119、a120,(10)e198、y119、a120,(11)e198、y119、a120,(12)e198、y119、a120,(13)s38、e198、y119、a120,(14)s38、e198、y119、a120,(15)y109、e198、y119、a120,(16)y109、e198、y119、a120,(17)y109、e198、y119、a120,(18)y109、e198、y119、a120,(19)s126、e198、y119、a120,(20)s126、e198、y119、a120,(21)s126、e198、y119、a120,(22)s126、e198、y119、a120,(23)h196、e198、y119、a120,(24)a50、i94、y119、a120，

7、更优选地，s38突变为p，a50突变为t，i94突变为l，y109突变为f，t113突变为f、i、w、v，a114突变为r、n、y、a、q、s或v，a118突变为l、f，y119突变为f、y、l、p或w，a120突变为e、f、p或v，s126突变为q，h196突变为a或s，e198突变为f、h、w或y，

8、更优选地，所述突变包含选自以下任一组的突变：(1)t113v、a114r，(2)t113v、a114n，(3)t113f、a114y，(4)t113i、a114a，(5)t113f、a114q，(6)t113w、a114s，(7)t113w、a114v，(8)y119f、a120f，(9)y119l、a120e，(10)y119y、a120p，(11)y119p、a120v，(12)y119l、a120f，(13)a118l、y119w，(14)a118f、y119y，(15)s38p、y119p、a120v，(16)y109f、y119p、a120v，(17)s126q、y119p、a120v，(18)h196a、y119p、a120v，(19)h196s、y119p、a120v，(20)e198f、y119p、a120v，(21)e198h、y119p、a120v，(22)e198w、y119p、a120v，(23)e198y、y119p、a120v，(24)s38p、e198f、y119p、a120v，(25)s38p、e198y、y119p、a120v，(26)y109f、e198f、y119p、a120v，(27)y109f、e198h、y119p、a120v，(28)y109f、e198w、y119p、a120v，(29)y109f、e198y、y119p、a120v，(30)s126q、e198f、y119p、a120v，(31)s126q、e198h、y119p、a120v，(32)s126q、e198w、y119p、a120v，(33)s126q、e198y、y119p、a120v，(34)h196s、e198y、y119p、a120v，(35)a50t、i94l、y119y、a120v。

9、本发明另一方面提供了一种衣康酸光学探针，包括：

10、(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119，所述衣康酸敏感多肽是衣康酸结合蛋白或其功能变体，所述光学活性多肽是荧光蛋白或其功能变体，

11、(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。

12、在一个或多个实施方案中，所述衣康酸敏感多肽具有：

13、(i)seq id no:1所示的序列，或与其有至少70％序列相同性并保留对衣康酸结合活性的序列，

14、(ii)本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列，或

15、(iii)与(ii)所述序列具有至少70％序列相同性并具有(ii)所述突变并保留对衣康酸敏感性的序列。

16、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽具有：

17、(a)seq id no:2-5中任一所示的序列，

18、(b)seq id no:2所示的序列并且在y1、n246位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述y1突变为y1f、y1g、y1h、y1i、y1p、y1w或y1v，所述n246突变为n246k或n246c，

19、(c)seq id no:5所示的序列并且在v1位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述v1突变为v1y，或

20、(d)与(a)、(b)或(c)有至少70％序列相同性并保留荧光蛋白功能的变体序列。

21、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列；所述光学活性多肽具有：(a)seq id no:2-5中任一所示的序列，(b)seq id no:2所示的序列并且在y1、n246位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述y1突变为y1f、y1g、y1h、y1i、y1p、y1w或y1v，所述n246突变为n246k或n246c，或(c)seq id no:5所示的序列并且在v1位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述v1突变为v1y，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

22、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列；所述光学活性多肽具有：(a)seq id no:2-5中任一所示的序列，(b)seq id no:2所示的序列并且在y1、n246位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述y1突变为y1f、y1g、y1h、y1i、y1p、y1w或y1v，所述n246突变为n246k或n246c，或(c)seq id no:5所示的序列并且在v1位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述v1突变为v1y，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

23、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:2中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

24、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:2中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

25、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:3中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

26、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:4中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

27、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120，所述衣康酸敏感多肽具有seq id no:1所示的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:5中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

28、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:2中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

29、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:3中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

30、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:4中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

31、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列，所述光学活性多肽具有seq id no:5中任一所示的序列，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

32、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列；所述光学活性多肽具有seq id no:2所示的序列并且在y1、n246位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失，优选地，所述y1突变为y1f、y1g、y1h、y1i、y1p、y1w或y1v，所述n246突变为n246k或n246c，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

33、在一个或多个实施方案中，衣康酸光学探针包括：(1)衣康酸敏感多肽和光学活性多肽，其中光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：41/42、41/43、41/44、41/45、41/46、42/42、42/43、42/44、42/45、42/46、112/113、112/114、112/115、113/113、113/114、113/115、114/113、114/114、114/115、117/117、117/118、117/119、117/120、118/117、118/118、118/119、118/120、119/117、119/118、119/119和/或119/120；所述衣康酸敏感多肽具有本发明第一方面所述的衣康酸结合蛋白变体的序列；所述光学活性多肽具有seq id no:5所示的序列并且在v1位点具有突变，所述突变包括氨基酸的修饰、取代或缺失；优选地，所述v1突变为v1y，或(2)与(1)具有至少90％序列相同性并保留对衣康酸结合和检测能力的序列。优选地，光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽的选自以下的一个或多个位点：114/113和119/119。

34、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽n端部分和c端部分，所述光学探针从n端至c端依次包含，序列如seq id no:1的第1-x位残基所示的衣康酸敏感多肽n端部分、seq id no:2-5中任一项所示的光学活性多肽或其功能变体和序列如seq id no:1的第y-300位残基所示的衣康酸敏感多肽c端部分，其中，

35、x和y是选自以下任一组：(1)x是41，y是42，(2)x是41，y是43，(3)x是41，y是44，(4)x是41，y是45，(5)x是41，y是46，(6)x是42，y是42，(7)x是42，y是43，(8)x是42，y是44，(9)x是42，y是45，(10)x是42，y是46，(11)x是112，y是113，(12)x是112，y是114，(13)x是112，y是115，(14)x是113，y是113，(15)x是113，y是114，(16)x是113，y是115，(17)x是114，y是113，(18)x是114，y是114，(19)x是114，y是115，(20)x是117，y是117，(21)x是117，y是118，(22)x是117，y是119，(23)x是117，y是120，(24)x是118，y是117，(25)x是118，y是118，(26)x是118，y是119，(27)x是118，y是120，(28)x是119，y是117，(29)x是119，y是118，(30)x是119，y是119，(31)x是119，y是120，和

36、所述光学探针包含选自以下任一组的突变：(1)衣康酸敏感多肽n端部分的t113v、a114r和光学活性多肽的y1v，(2)衣康酸敏感多肽n端部分的t113v、a114n和光学活性多肽的y1w，(3)衣康酸敏感多肽n端部分的t113f、a114y和光学活性多肽的y1h，(4)衣康酸敏感多肽n端部分的t113i、a114a和光学活性多肽的y1f，(5)衣康酸敏感多肽n端部分的t113f、a114q和光学活性多肽的y1w，(6)衣康酸敏感多肽n端部分的t113w、a114s和光学活性多肽的y1v，(7)衣康酸敏感多肽n端部分的t113w、a114v和光学活性多肽的y1w，(8)衣康酸敏感多肽n端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的y1i，(9)衣康酸敏感多肽n端部分的y119l、a120e和光学活性多肽的y1f，(10)衣康酸敏感多肽c端部分的y119y、a120p，(11)衣康酸敏感多肽c端部分的y119p、a120v，(12)衣康酸敏感多肽c端部分的y119l、a120f，(13)衣康酸敏感多肽c端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的n246k，(14)衣康酸敏感多肽c端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的n246c，(15)衣康酸敏感多肽c端部分的y119l、a120e和光学活性多肽的n246c，(16)衣康酸敏感多肽n端部分的a118l、y119w和光学活性多肽的v1y，(17)衣康酸敏感多肽n端部分的a118f和光学活性多肽的v1y，((18)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的y119p、a120v，(19)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的y119p、a120v，(20)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、y119p、a120v，(21)衣康酸敏感多肽c端部分的h196a、y119p、a120v，(22)衣康酸敏感多肽c端部分的h196s、y119p、a120v，(23)衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(24)衣康酸敏感多肽c端部分的e198h、y119p、a120v，(25)衣康酸敏感多肽c端部分的e198w、y119p、a120v，(26)衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(27)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(28)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(29)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(30)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198h、y119p、a120v，(31)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198w、y119p、a120v，(32)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(33)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198f、y119p、a120v，(34)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198h、y119p、a120v，(35)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198w、y119p、a120v，(36)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198y、y119p、a120v，(37)衣康酸敏感多肽c端部分的h196s、e198y、y119p、a120v，(38)衣康酸敏感多肽n端部分的a50t、i94l和衣康酸敏感多肽c端部分的y119y、a120v。

37、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽n端部分和c端部分，所述光学探针从n端至c端依次包含，序列如seq id no:1的第1-x位残基所示的衣康酸敏感多肽n端部分、seq id no:2-5中任一项(优选seq id no:2)所示的光学活性多肽或其功能变体和序列如seq id no:1的第y-300位残基所示的衣康酸敏感多肽c端部分，其中，x是114，y是113，并且，所述光学探针包含选自以下任一组的突变：(1)衣康酸敏感多肽n端部分的t113v、a114r和光学活性多肽的y1v，(2)衣康酸敏感多肽n端部分的t113v、a114n和光学活性多肽的y1w，(3)衣康酸敏感多肽n端部分的t113f、a114y和光学活性多肽的y1h，(4)衣康酸敏感多肽n端部分的t113i、a114a和光学活性多肽的y1f，(5)衣康酸敏感多肽n端部分的t113f、a114q和光学活性多肽的y1w，(6)衣康酸敏感多肽n端部分的t113w、a114s和光学活性多肽的y1v，(7)衣康酸敏感多肽n端部分的t113w、a114v和光学活性多肽的y1w。

38、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽n端部分和c端部分，所述光学探针从n端至c端依次包含，序列如seq id no:1的第1-x位残基所示的衣康酸敏感多肽n端部分、seq id no:2-5中任一项(优选seq id no:2)所示的光学活性多肽或其功能变体和序列如seq id no:1的第y-300位残基所示的衣康酸敏感多肽c端部分，其中，x是119，y是119，并且，所述光学探针包含选自以下任一组的突变：(1)衣康酸敏感多肽n端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的y1i，(2)衣康酸敏感多肽n端部分的y119l、a120e和光学活性多肽的y1f，(3)衣康酸敏感多肽r端部分的y119y、a120p，(4)衣康酸敏感多肽r端部分的y119p、a120v，(5)衣康酸敏感多肽r端部分的y119l、a120f，(6)衣康酸敏感多肽r端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的n246k，(7)衣康酸敏感多肽r端部分的y119f、a120f和光学活性多肽的n246c，(8)衣康酸敏感多肽r端部分的y119l、a120e和光学活性多肽的n246c，(9)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的y119p、a120v，(10)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的y119p、a120v，(11)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、y119p、a120v，(12)衣康酸敏感多肽c端部分的h196a、y119p、a120v，(13)衣康酸敏感多肽c端部分的h196s、y119p、a120v，(14)衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(15)衣康酸敏感多肽c端部分的e198h、y119p、a120v，(16)衣康酸敏感多肽c端部分的e198w、y119p、a120v，(17)衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(18)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(19)衣康酸敏感多肽n端部分的s38p和衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(20)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198f、y119p、a120v，(21)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198h、y119p、a120v，(22)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198w、y119p、a120v，(23)衣康酸敏感多肽n端部分的y109f和衣康酸敏感多肽c端部分的e198y、y119p、a120v，(24)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198f、y119p、a120v，(25)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198h、y119p、a120v，(26)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198w、y119p、a120v，(27)衣康酸敏感多肽c端部分的s126q、e198y、y119p、a120v，(28)衣康酸敏感多肽c端部分的h196s、e198y、y119p、a120v，(29)衣康酸敏感多肽n端部分的a50t、i94l和衣康酸敏感多肽c端部分的y119y、a120v。

39、在一个或多个实施方案中，所述光学活性多肽位于衣康酸敏感多肽n端部分和c端部分，所述光学探针从n端至c端依次包含，序列如seq id no:1的第1-x位残基所示的衣康酸敏感多肽n端部分、seq id no:2-5中任一项(优选seq id no:5)所示的光学活性多肽或其功能变体和序列如seq id no:1的第y-300位残基所示的衣康酸敏感多肽c端部分，其中，x是119，y是117，并且，所述光学探针包含选自以下任一组的突变：(1)衣康酸敏感多肽n端部分的a118l、y119w和光学活性多肽的v1y，(2)衣康酸敏感多肽n端部分的a118f和光学活性多肽的v1y。

40、本发明另一方面还提供融合多肽，包含本文任一实施方案所述衣康酸光学探针和功能多肽，优选地，所述功能多肽为定位序列、便于纯化的标签或者用于免疫反应的标签。

41、在一个或多个实施方案中，所述定位序列包括但不限于将光学探针定位到不同细胞器或亚细胞器的多肽。

42、在一个或多个实施方案中，所述免疫反应包括但不限于免疫印迹。

43、在一个或多个实施方案中，所述融合多肽中的光学探针和功能多肽之间具有/或不具有接头。

44、本发明另一方面还提供一种核酸分子，其包含：

45、(a)本文任一实施方案所述的衣康酸结合蛋白变体、衣康酸光学探针、融合多肽的编码序列，

46、(b)与(a)所示序列有至少80％(较佳地至少90％)相同性的核酸序列或其互补序列，或

47、(c)(a)或(b)的引物片段。

48、在一个或多个实施方案中，所述核酸序列包含编码seq id no:6-12中任一所示氨基酸序列。

49、在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸还包括上述核酸序列的的片段、类似物、衍生物、可溶性片段和变体的核酸序列或其互补序列。

50、本发明另一方面还提供一种核酸构建物，其包含本文任一实施方案所述的核酸分子。

51、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或重组载体。

52、在一个或多个实施方案中，所述核酸分子与表达控制序列操作性连接。

53、在一些实施方案中，表达载体选自原核表达载体、真核表达载体和病毒载体。

54、本发明另一方面还提供包含一种宿主细胞，所述宿主细胞：(1)表达本发明任一实施方案所述的光学探针或融合多肽；(2)包含本发明任一实施方案所述的核酸分子；或(3)包含本发明任一实施方案所述的核酸构建物。所述宿主细胞优选大肠杆菌。

55、本发明另一方面还提供衣康酸检测试剂盒，其包含：

56、(1)本文任一实施方案所述的光学探针，

57、(2)本文任一实施方案所述的核酸序列，

58、(3)本文任一实施方案所述的核酸构建物，或

59、(4)本文任一实施方案的宿主细胞，

60、所述检测试剂盒任选还包含利用光学探针检测衣康酸所需的其他试剂，

61、优选地，所述检测试剂盒还包含选自以下的一种或多种试剂：缓冲液、培养基、衣康酸标准品。

62、本发明另一方面提供制备本文所述光学探针的方法，包括：提供表达本文所述光学探针或融合多肽的宿主细胞，在所述细胞表达的条件下培养所述宿主细胞，和分离光学探针或融合多肽。

63、在一个或多个实施方案中，制备本文所述衣康酸光学探针或融合多肽的方法包括以下步骤：1)将编码本文所述衣康酸光学探针的表达载体转移到宿主细胞中；2)在适合所述表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，3)分离衣康酸光学探针。

64、本发明另一方面提供检测样品中衣康酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与样品接触，和检测光学活性多肽的变化。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位进行。所述样品例如血液。

65、本发明另一方面提供定量样品中衣康酸的方法，包括：使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与样品接触，检测光学活性多肽的变化，和根据光学活性多肽的变化定量样品中的衣康酸。

66、本发明另一方面提供筛选化合物(例如药物)的方法，包括：在含衣康酸的体系中使本文所述光学探针或融合多肽或如本文所述方法制备的光学探针或融合多肽与候选化合物接触，检测光学活性多肽的变化，和根据光学活性多肽的变化筛选化合物。所述方法可以高通量地筛选化合物。

67、在一个或多个实施方案中，在含衣康酸的体系中使本文所述宿主细胞与候选化合物接触，并且光学活性多肽的光学变化指示所述候选化合物是否能调节细胞对衣康酸的摄取。

68、本发明另一方面还提供对所述衣康酸进行细胞内和/或外定位的方法，包括：将含衣康酸的体系与所述光学探针或所述宿主细胞接触，和检测光学活性多肽的光学变化。

69、在一个或多个实施方案中，所述体系是溶液体系、细胞体系、亚细胞体系。

70、本发明另一方面还提供本文所述衣康酸光学探针或融合多肽或宿主细胞在检测样品中的衣康酸、筛选化合物或衣康酸细胞内/外定位中的应用。在一个或多个实施方案中，所述定位是实时定位。

71、本发明的有益效果：本发明提供的衣康酸光学探针易于成熟，荧光动态变化大，特异性好，并且能够通过基因操作的方法在细胞中表达，可在细胞内外实时定位、高通量、定量检测衣康酸，省去了耗时的处理样品步骤。实验效果表明本技术所提供的衣康酸光学探针对衣康酸的最高响应达到对照的3倍以上，并且可以在细胞浆、线粒体、细胞核、内质网、溶酶体和高尔基体等亚细胞结构中对细胞进行定位、定性、定量检测，并且可以进行高通量的化合物筛选以及血液中衣康酸定量检测。