一种含甲酰胺苯并咪唑侧链单元的NHS连接子、砹-211放射性靶向偶联分子及其制备方法与应用与流程

本发明涉及放射性药物化学与核医学领域，尤其涉及一种含甲酰胺苯并咪唑侧链单元的nhs连接子、砹-211放射性靶向偶联分子及其制备方法与应用。

背景技术：

1、靶向α核素治疗（targeted radionuclide therapy, trt）是肿瘤精准治疗的前沿方向。砹-211（at-211）物理半衰期7.2h，释放高能α粒子，是临床转化潜力极高的治疗型核素。纳米抗体（vhh）分子量仅约15kda，组织穿透能力强、抗原识别特异性高，其快速的体内清除特性与at-211短半衰期高度匹配，是理想的靶向递送载体。

2、然而，将at-211与纳米抗体结合用于肿瘤治疗，现有技术仍面临以下核心瓶颈：直接亲电标记法将at-211连接于纳米抗体表面酪氨酸残基，形成芳基c-at键，该键在体内还原性微环境或脱卤酶作用下极易断裂，游离at-特异性蓄积于甲状腺、胃黏膜，诱发正常器官辐射毒性。此外，at-211标记位点与纳米抗体抗原结合cdr区间距极短，at-211衰变释放的α粒子及反冲核207bi会直接轰击蛋白肽链，引发二硫键断裂、芳香氨基酸氧化，导致偶联物抗原结合亲和力大幅下降。同时，直接标记需要高温、强氧化环境，蛋白易变性，标记产率不足30%。n-琥珀酰亚胺基-4-胍基甲基-3-三甲基锡苯甲酸酯（sgmtb）是目前at-211标记抗体/纳米抗体领域验证最充分的连接试剂，但存在以下固有缺陷：仅含单苄基柔性短链，标记位点与蛋白之间缺乏刚性空间隔离，无法缓解自辐照损伤；缺少药代调控模块，不能改善纳米抗体肾脏超快清除问题；苄基柔性链易发生分子内折叠，降低标记效率。

3、综上，现有技术中sgmtb连接子存在缺乏刚性空间隔离、无药代调控模块、柔性链构象不稳定易降低标记效率、前体需脱保护导致放射性操作步骤繁琐的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是：如何改进连接子的化学结构，以解决现有sgmtb连接子因结构缺陷导致的蛋白自辐照失活、肾清除过快、标记效率低和操作复杂的问题。

2、为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种含甲酰胺苯并咪唑侧链单元的nhs连接子，其化学结构如式i所示：

3、式i；

4、其中，r选自-snme3、-snbu3、-b(oh)2、-b(or')2、-sime3和-geme3中的一种，其中r'为c1-c6烷基。

5、本发明公开了一种用于砹-211标记纳米抗体的多功能刚性nhs连接子，其以4-甲酰胺苯并咪唑为刚性芳香母核；一端为含有能够被砹-211亲电取代的离去基团的苯环，另一端设置有用于蛋白偶联的nhs活性酯；苯并咪唑与甲酰胺基能够保护砹-211，使其不易被酶氧化为高价态，抑制砹-211脱落，并可调节分子亲疏水平衡；该nhs连接子集成辐射隔离、药代调控、砹-211标记、蛋白偶联及滞留时间长五大功能。

6、本发明第二方面提供上述nhs连接子的制备方法，包括以下步骤：

7、a1、提供r基团取代的苯环前体；

8、a2、将步骤a1产物与2,3-二氨基苯甲酰胺在还原剂存在下反应，构建苯并咪唑环；

9、a3、将步骤a2产物进行水解反应；

10、a4、将步骤a3产物与n-羟基琥珀酰亚胺在缩合剂存在下反应，得到nhs连接子。

11、上述制备方法以卤代芳醛为起始原料，经偶联反应引入r基团（例如通过stille偶联引入三甲基锡基）、与2,3-二氨基苯甲酰胺缩合环化构建苯并咪唑母核、选择性水解以及缩合引入nhs活性酯四步反应，制得式i所示nhs连接子。该方法各步反应条件温和、操作简便，产物经制备型hplc纯化后纯度可达90%。

12、本发明第三方面提供一种砹-211标记连接子中间体，其化学结构如式ii所示：

13、式ii。

14、本发明提供的砹-211标记连接子中间体，由上述的nhs连接子经亲电取代反应引入砹-211制得，其中三甲基锡基团被砹-211取代，形成芳基c-at化学键。芳基c-at键具有较强的抗水解和抗还原能力，在体内还原性微环境下不易断裂，从而显著降低游离砹离子在甲状腺和胃黏膜的异常蓄积，减少正常器官的辐射毒性。

15、本发明第四方面提供一种上述砹-211标记连接子中间体的制备方法，包括以下步骤：

16、b1、将上述的nhs连接子溶于含n-氯代丁二酰亚胺和冰醋酸的甲醇溶液中，得到反应液；

17、b2、向所述反应液中加入砹-211，振荡后静置反应，使所述nhs连接子中的r基团被砹-211取代，生成砹-211标记的连接子中间体；

18、b3、反应结束后，吹干溶剂，加入乙酸乙酯溶解并再次吹干；

19、b4、加入乙酸乙酯-正己烷混合溶剂，经hplc分离纯化，收集产物，吹干，得到砹-211标记连接子中间体。

20、该制备方法以n-氯代丁二酰亚胺（ncs）为氧化剂，通过亲电取代反应在室温条件下引入砹-211，经hplc分离纯化即得标记物。该方法无需高温或强氧化条件，反应条件温和；同时hplc纯化可有效去除未反应的连接子和副产物，获得高纯度的标记中间体，且nhs活性酯基团在标记和纯化过程中保持完整，无需额外活化即可直接用于后续偶联反应。

21、本发明第五方面提供一种砹-211放射性靶向偶联分子，其化学结构如式iii所示：

22、式iii；

23、其中，sdab为纳米抗体。

24、本发明提供的砹-211放射性靶向偶联分子，由砹-211标记连接子中间体与纳米抗体经酰胺化偶联制得，砹-211标记连接子中间体中的n-羟基琥珀酰亚胺活性酯基团与纳米抗体表面赖氨酸的伯氨基发生偶联，形成稳定的酰胺键。偶联分子进入肿瘤细胞溶酶体后，4-甲酰胺苯并咪唑母核因自带极性带电结构而发生电荷滞留，延长了砹-211放射性核素在肿瘤细胞内的驻留时间，为α粒子充分发挥其dna双链断裂杀伤效应创造有利条件，从而提升靶向α放射治疗的治疗效果。

25、本发明第六方面提供一种上述砹-211放射性靶向偶联分子的制备方法，包括以下步骤：

26、c1、将纳米抗体溶于硼酸盐缓冲液中，得到蛋白体系；

27、c2、将上述的砹-211标记连接子中间体加入所述蛋白体系，20~30℃避光孵育，使所述砹-211标记连接子中间体与所述纳米抗体发生酰胺化偶联；

28、c3、经凝胶过滤纯化，收集产物，得到砹-211放射性靶向偶联分子。

29、该制备方法将砹-211标记连接子中间体与纳米抗体在硼酸盐缓冲液中室温避光孵育，再经凝胶过滤纯化即得终产物，工艺全程在温和条件下进行，避免了强氧化或高温条件对纳米抗体蛋白活性的破坏；凝胶过滤纯化操作简便，可快速去除未偶联的小分子标记物，适用于放射性药物的快速制备。

30、进一步地，所述步骤c3中，得到的砹-211放射性靶向偶联分子的放射化学纯度≥95%，蛋白单体纯度≥90%。高放射化学纯度确保给药制剂中放射性杂质含量低，减少非特异性辐射损伤；高蛋白单体纯度表明偶联过程中纳米抗体未发生明显聚集或降解，保留了良好的抗原结合活性，两者共同保证产品的有效性和安全性。

31、进一步地，所述步骤c1中，所述蛋白体系中纳米抗体的浓度为2~5mg/ml。该浓度范围保证了纳米抗体分子在溶液中处于适度分散状态，既提供了充足的赖氨酸伯氨基与nhs酯发生反应，又避免过高浓度导致的分子间聚集，确保了偶联反应的高效进行和产物均一性。

32、进一步地，所述步骤c2中，所述砹-211标记连接子中间体与所述纳米抗体的摩尔比为1:8~1:20。该比例范围使标记物相对于纳米抗体适度过量，确保纳米抗体分子上连接足够数量的砹-211标记连接子中间体以满足放射性剂量需求，同时避免过量小分子标记物对后续纯化分离造成困难，兼顾了偶联效率和产物纯度。

33、本发明第七方面提供一种上述砹-211放射性靶向偶联分子在制备用于实体瘤的靶向α粒子放射治疗药物中的应用。本发明的砹-211放射性靶向偶联分子利用纳米抗体对实体瘤抗原的高特异性识别能力实现肿瘤主动靶向，经受体介导内吞进入肿瘤细胞后，砹-211发射的高能α粒子在短射程内高效杀伤肿瘤细胞，同时芳基c-at键的高稳定性降低了脱靶毒性，提高了治疗的安全性。

34、综上所述，相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

35、（1）本发明提供一种含甲酰胺苯并咪唑侧链单元的nhs连接子，其以4-甲酰胺苯并咪唑为刚性芳香母核，一端连接含离去基团的苯环作为亲电取代标记位点，另一端自带nhs活性酯基团。该连接子集离去基团标记位点、nhs活性酯偶联基团、刚性芳香骨架、极性调节基团于单一分子，实现了辐射隔离、药代调控、高效标记、蛋白偶联和溶酶体滞留五大功能的一体化整合，从根本上克服了现有sgmtb连接子结构设计上的多重缺陷。

36、（2）本发明nhs连接子预先安装nhs活性酯基团，可在完成砹-211标记后直接与纳米抗体表面赖氨酸的伯氨基发生酰胺化偶联，无需在放射性环境下进行额外的活化步骤。这一设计大幅简化了放射性操作流程，缩短了操作人员的辐射暴露时间，同时降低了产物损耗，使本发明更适合放射性药物的临床转化和规模化生产。

37、（3）本发明nhs连接子以苯并咪唑母核与苯环构成全刚性共轭骨架，将砹-211衰变位点与纳米抗体抗原结合区进行有效空间隔离。该刚性结构能够阻挡α粒子和反冲核直接轰击蛋白肽链，显著缓解自辐照导致的纳米抗体亲和力下降和活性丧失，同时消除了柔性链构象不稳定导致的标记效率降低问题。

38、（4）本发明nhs连接子通过4-甲酰胺基团调节整体分子的亲疏水平衡，改善了纳米抗体因分子量过小而导致的肾脏超快清除问题，有效降低了肾脏放射性峰值蓄积并延长了肿瘤辐射暴露时间，显著提升了肿瘤/肾脏靶本比，拓宽了治疗窗口。同时，该连接子无需借助胍基结构，仅依靠4-甲酰胺苯并咪唑母核自身的极性带电特性即可在溶酶体中实现放射性滞留，避免了高正电荷基团可能导致的非特异性脏器吸附问题，分子设计更为简洁。

39、（5）本发明砹-211放射性靶向偶联分子具有优异的芳基c-at键稳定性，在体内还原性微环境下不易脱砹，兼具高靶向效率、长效肿瘤滞留和低正常器官辐射暴露的综合优势，可作为实体瘤靶向α粒子放射治疗的候选放射性药物。