早期宫颈癌诊断标志物及其应用的制作方法

本发明涉及宫颈癌检测，具体而言，涉及早期宫颈癌诊断标志物及其应用。

背景技术：

1、宫颈癌是女性生殖系统恶性肿瘤中发病率最高的病种，其发病人数显著超过子宫内膜癌与卵巢癌的发病总和。根据2022年全球癌症统计数据显示，宫颈癌新发病例达66.2万例，死亡病例34.9万例，其发病率和死亡率在女性恶性肿瘤中均位列第四位。由于宫颈癌早期临床症状多不典型，多数患者确诊时已进展至中晚期，严重影响治疗效果及预后。

2、宫颈细胞学检查（tct）作为目前最常用的筛查手段之一，属于形态学检测范畴，其检测效能高度依赖于采样质量与操作规范，且存在判读主观性强、重复性差、灵敏度不足等技术局限，导致临床漏诊率较高。传统血清学肿瘤标志物（如ca125、scc等）虽已广泛应用于宫颈癌的辅助诊断、疗效监测及预后评估，但易受盆腔炎、子宫内膜异位症等良性妇科疾病干扰，假阳性率较高；同时部分早期恶性病变患者血清标志物水平未见显著升高，存在假阴性风险，难以实现宫颈癌的精准早期筛查。近年来，基于循环游离dna（cfdna）及循环肿瘤dna（ctdna）的液体活检技术在妇科肿瘤领域取得重要进展，其中dna甲基化检测技术因其能够精准识别肿瘤发生早期的表观遗传学异常，已成为宫颈癌早期筛查与诊断的核心研究方向。多项临床研究证实，在宫颈癌变发生的极早期阶段即可出现基因组cpg岛异常甲基化修饰，主要表现为抑癌基因启动子区高甲基化导致的基因沉默及功能丧失，以及原癌基因相关区域低甲基化引发的基因组不稳定性，共同驱动宫颈上皮细胞的异常增殖与恶性转化。通过检测阴道分泌物中脱落细胞的甲基化特征，可实现无创性捕获宫颈癌特异性分子异常信号。

3、目前基于阴道分泌物的宫颈癌早期甲基化检测技术主要包括：甲基化特异性pcr（msp）、实时荧光定量甲基化pcr（qmsp）、数字pcr（ddpcr）、靶向甲基化二代测序以及全基因组甲基化测序等方法。随着高通量测序技术的发展，基于多基因甲基化位点联合分析的检测模型逐渐成为主流技术路线，通过整合多个差异甲基化区域（dmrs）数据并应用机器学习算法构建分类模型，可显著提升检测性能。然而现有技术仍存在若干亟待解决的问题：不同研究采用的甲基化标志物缺乏标准化；早期病变ctdna含量低导致检测灵敏度受限；以及高通量测序成本较高、数据分析复杂等技术瓶颈。因此，开发具有更高特异性与灵敏度、适用于大规模人群筛查的阴道分泌物甲基化标志物及其检测方法，仍是当前研究领域的重要方向。

4、dna甲基化异常作为肿瘤发生发展过程中的早期分子事件，其甲基化模式一旦形成通常需要长期环境刺激才会发生改变，因此可作为肿瘤早期筛查、辅助诊断及预后评估的重要分子标志物。当前基于定量pcr（q-pcr）的第一代甲基化检测技术仅能提供个别基因特定位点的定性检测结果，存在检测范围局限、灵敏度不足等缺陷；而基于新一代测序（ngs）的高通量甲基化检测技术则可实现特定基因多位点甲基化率的精确定量，并能同时对大量基因的甲基化状态进行全景式分析，显著提高了检测准确性。此外，ngs技术可支持大规模样本平行检测，有效降低单位检测成本并缩短检测周期，已成为当前及未来肿瘤早期甲基化检测的主流技术方案。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供早期宫颈癌诊断标志物及其应用，通过对宫颈癌特异的多个甲基化标志物基因进行定量检测，实现高灵敏度、高特异度、快速的早期宫颈癌信号检测。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种检测甲基化标志物组合的试剂在制备早期宫颈癌辅助诊断或诊断产品中的应用，检测甲基化标志物组合的试剂用于检测甲基化标志物组合的甲基化水平，甲基化标志物组合包括标志物1-标志物12，以grch37为参考基因组，各个标志物的位置信息如下：

4、标志物1：chr5:115151893-115152043，标志物2：chr11:101000324-101000474，标志物3：chr3:68981579-68981724，标志物4：chr6:123317421-123317570，标志物5：chr19:52222597-52222745，标志物6：chr19:58220323-58220466，标志物7：chr2:95691383-95691528，标志物8：chr20:57875890-57876033，标志物9：chr11:101000335-101000484，标志物10：chr19:30019567-30019706，标志物11：chr13:112722947-112723090，标志物12：chr7:19157542-19157685。

5、第二方面，本发明提供了一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断的引物组合，其包括用于检测上述标志物1-标志物12的引物组合，引物组合包括：分别用于检测标志物1-标志物12的第一引物对-第十二引物对，第一引物对-第十二引物对的核苷酸序列依次如seq idno.1- seq id no.24所示。

6、第三方面，本发明提供了一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断产品，产品选自试剂盒、生物芯片或检测装置，其包括用于早期宫颈癌辅助诊断或诊断的引物组合。

7、第四方面，本发明提供了一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法，其包括如下步骤：

8、获取代表训练样本中的上述甲基化标志物组合中的每一个标志物所在区域的甲基化率，建立数据集；利用数据集通过机器学习模型，构建早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型；

9、机器学习模型选自如下至少一种：逻辑回归、随机森林、k近邻、支持向量机、adaboost、xgboost、朴素贝叶斯和dt决策树。

10、第五方面，本发明提供了一种用于早期宫颈癌辅助诊断或诊断的设备，设备包括处理器和存储器，存储器中存储有可执行程序指令集合，可执行程序指令集合由处理器加载并执行以实现上述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法，并进行早期宫颈癌的辅助诊断或诊断。

11、第六方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，存储介质中存储有可执行程序指令集合，可执行程序指令集合由处理器加载并执行上述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法。

12、本发明具有以下有益效果：

13、本发明通过多轮实验筛选候选标志物在阴道分泌物样本中的性能，基于甲基化率、测序深度、贡献率和特异性等指标，筛选出具有高灵敏度和高特异度的诊断标志物。相比传统影像学、内镜或血清标志物（如cea、scc），本发明提供的诊断标志物更适合早期筛查，具有高灵敏度、高特异度的技术优势，能实现非侵入性早期信号检测，适用于大规模筛查。

14、本发明提供的甲基化标志物组合，支持多种样本类型，并可扩展到预后评估，帮助患者提前干预，提高生存率。基于该标志物的诊断应用以及诊断方法，可使用标准设备（如illumina miniseq）和试剂盒，具有检测成本低，操作标准化，适用于临床推广的技术优势。

1.一种检测甲基化标志物组合的试剂在制备早期宫颈癌辅助诊断或诊断产品中的应用，其特征在于，所述检测甲基化标志物组合的试剂用于检测甲基化标志物组合的甲基化水平，所述甲基化标志物组合包括标志物1-标志物12，以grch37为参考基因组，各个标志物的位置信息如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测甲基化标志物组合的试剂选自如下至少一种检测甲基化标志物组合的甲基化水平的方法所使用的试剂：

3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测甲基化标志物组合的试剂包括检测甲基化标志物组合的引物，所述引物包括：分别用于检测标志物1-标志物12的第一引物对-第十二引物对，所述第一引物对-第十二引物对的核苷酸序列依次如seq id no.1-seq id no.24所示；

4.一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断的引物组合，其特征在于，其包括用于检测权利要求1-3中任一项中所述的标志物1-标志物12的引物组合，所述引物组合包括：分别用于检测标志物1-标志物12的第一引物对-第十二引物对，所述第一引物对-第十二引物对的核苷酸序列依次如seq id no.1- seq id no.24所示。

5.一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断产品，所述产品选自试剂盒、生物芯片或检测装置，其特征在于，其包括权利要求4所述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断的引物组合。

6.根据权利要求5所述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断产品，其特征在于，所述产品还包括用检测内参基因actb的引物，其引物序列如seq id no.25- seq id no.26所示。

7.一种早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法，其特征在于，当所述机器学习模型为逻辑回归时，基于所测样本中的甲基化标志物组合中的每一个标志物所在区域所有甲基化位点的平均甲基化率，计算获得早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的模型预测值：

9.一种用于早期宫颈癌辅助诊断或诊断的设备，其特征在于，所述设备包括处理器和存储器，存储器中存储有可执行程序指令集合，可执行程序指令集合由处理器加载并执行以实现权利要求7-8任一项所述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法，并进行早期宫颈癌的辅助诊断或诊断。

10.一种计算机可读存储介质，存储介质中存储有可执行程序指令集合，可执行程序指令集合由处理器加载并执行权利要求7-8任一项所述的早期宫颈癌辅助诊断或诊断模型的构建方法。