一种靶向成纤维细胞活化蛋白的单克隆抗体及其应用

本发明涉及一种靶向成纤维细胞活化蛋白的单克隆抗体及其应用，属于生物医药。

背景技术：

1、嵌合抗原受体t细胞（car-t）技术近年来在肿瘤免疫治疗中取得了显著进展，但其在非肿瘤性疾病中的应用仍处于探索阶段。成纤维细胞活化蛋白（fap）在肝纤维化、肺纤维化等纤维化疾病中高表达，因此成为相应疾病的潜在治疗靶点。目前，已经有研究尝试将靶向fap的car-t细胞应用于纤维化疾病的治疗（具体可参见公开号为cn118496382a的专利申请文本），然而，现阶段，该类技术仍存在许多问题。

2、例如，由于fap在部分正常组织中亦存在低水平表达，增加了抗体脱靶结合的风险；同时，fap具有较为复杂的空间构象，使得能够特异性识别其天然表位的抗体筛选难度较高；此外，现有抗fap抗体多来源于已知抗体，在抗原识别表位方面存在一定局限，因此，现有抗fap抗体难以兼顾较高的亲和力与较高的特异性。

3、例如，由于纤维化组织中存在免疫抑制性微环境，包括抑制性细胞因子、异常细胞外基质沉积以及t细胞浸润受限等因素，从而导致car-t细胞的细胞毒活性、细胞因子分泌能力及体内持续性受到影响，因此，即使采用现有抗fap抗体构建car-t细胞，其在纤维化相关微环境中的功能仍容易受到限制。

4、又例如，由于纤维化疾病的病理过程复杂，涉及多种细胞类型及信号通路，目前尚缺乏成熟稳定的评价体系；此外，现有car-t技术主要集中于肿瘤治疗，在纤维化疾病中的应用研究相对较少，因此，针对纤维化疾病开发安全、有效的car-t治疗策略仍存在较大的技术挑战。

5、可见，在纤维化疾病背景下，如何获得兼具高特异性和高功能活性的抗fap抗体，并基于该抗体构建能够在复杂纤维化微环境中保持良好效应功能和持续活性的car-t细胞，仍是本领域是亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种靶向成纤维细胞活化蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seqid no.4或seq id no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.8所示的cdr3，轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6或seq id no.7所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示的cdr3。

2、在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.11或seq id no.12所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.14或seq id no.15所示的fr2、氨基酸序列如seq id no.19或seq id no.20所示的fr3和氨基酸序列如seq idno.24所示的fr4，轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no.13所示的fr1、氨基酸序列如seq id no.16~seq id no.18任一所示的fr2、氨基酸序列如seq id no.21~seq id no.23任一所示的fr3和氨基酸序列如seq id no.25或seq id no.26所示的fr4。

3、在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体的重链包括：

4、（a）氨基酸序列如seq id no.58或seq id no.59所示的多肽；

5、（b）在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留其源自序列的生物学功能的由（a）衍生的衍生多肽；

6、所述单克隆抗体的轻链包括：

7、（c）氨基酸序列如seq id no.60~seq id no.62任一所示的多肽；

8、（d）在（c）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留其源自序列的生物学功能的由（c）衍生的衍生多肽。

9、在本发明的一种实施方式中，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq idno.58或seq id no.59所示；所述单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no.60~seq idno.62任一所示。

10、在本发明的一种实施方式中，编码所述单克隆抗体的重链的基因的核苷酸序列如seq id no.68~seq id no.70任一所示；编码所述单克隆抗体的轻链的基因的核苷酸序列如seq id no.71~seq id no.73任一所示。

11、优选的，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no.58所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.60所示；编码所述单克隆抗体的重链的基因的核苷酸序列如seq idno.68所示，轻链的基因的核苷酸序列如seq id no.71所示。

12、优选的，所述单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no.59所示，轻链的氨基酸序列如seq id no.62所示；编码所述单克隆抗体的重链的基因的核苷酸序列如seq idno.70所示，轻链的基因的核苷酸序列如seq id no.73所示。

13、第二方面，本发明提供了一种单链抗体，所述单链抗体包括如上所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

14、在本发明的一种实施方式中，所述单链抗体还包括将上述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区连接的连接肽。

15、在本发明的一种实施方式中，所述单链抗体包括：

16、（e）氨基酸序列如seq id no.80或seq id no.81所示的多肽；

17、（f）在（e）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留其源自序列的生物学功能的由（e）衍生的衍生多肽。

18、在本发明的一种实施方式中，所述单链抗体的氨基酸序列如seq id no.80或seqid no.81所示。

19、在本发明的一种实施方式中，编码所述单链抗体的基因的核苷酸序列如seq idno.82或seq id no.83所示。

20、第三方面，本发明提供了一种靶向成纤维细胞活化蛋白的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括car本体结构单元；所述car本体结构单元包括依次相连的靶向成纤维细胞活化蛋白的胞外识别域、胞外间隔区、跨膜区以及胞内信号转导结构域；所述胞外识别域包括依次相连的信号肽以及如上所述的单链抗体。

21、在本发明的一种实施方式中，所述信号肽为cd8α信号肽；所述胞外间隔区为cd8α的铰链区（cd8α hinge）；所述跨膜区为cd8α的跨膜区；所述胞内信号传导结构域包括4-1bb共刺激结构域和cd3ζ信号传导结构域。

22、在本发明的一种实施方式中，所述嵌合抗原受体包括：

23、（e）氨基酸序列如seq id no.84或seq id no.85所示的多肽；

24、（f）在（e）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留其源自序列的生物学功能的由（e）衍生的衍生多肽。

25、在本发明的一种实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.84或seq id no.85所示。

26、在本发明的一种实施方式中，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如seqid no.86或seq id no.87所示。

27、第四方面，本发明提供了一种多特异性抗体，所述多特异性抗体包括如上所述的单克隆抗体或单链抗体。

28、多特异性抗体（multispecific antibodies）是指可以同时结合两个或两个以上不同表位或抗原的抗体。

29、第五方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的单克隆抗体；或者，所述核酸分子编码如上所述的单链抗体；或者，所述核酸分子编码如上所述的嵌合抗原受体；或者，所述核酸分子编码如上所述的多特异性抗体。

30、第六方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带如上所述的核酸分子。

31、在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的质粒载体包括病毒载体和/或非病毒载体；所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体和/或腺病毒载体；所述非病毒载体包括pcdna3.4载体、pvax1载体、pegfp-n1载体、pef载体、pcmv载体和/或pires2载体。

32、第七方面，本发明提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞表达如上所述的单克隆抗体；或者，所述工程化细胞表达如上所述的单链抗体；或者，所述工程化细胞表达如上所述的嵌合抗原受体；或者，所述工程化细胞表达如上所述的多特异性抗体。

33、在本发明的一种实施方式中，所述工程化细胞的制备方法包括：将上述重组质粒转染至宿主细胞中；或者，所述工程化细胞的制备方法包括：将上述核酸分子整合至宿主细胞的基因组中。

34、在本发明的一种实施方式中，所述工程化细胞为car-t细胞。

35、第八方面，本发明提供了一种靶向成纤维细胞活化蛋白的药物，所述药物含有如上所述的单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗原受体、多特异性抗体、核酸分子、重组质粒和/或工程化细胞。

36、在本发明的一种实施方式中，所述药物用于预防和/或治疗与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的疾病。

37、在本发明的一种实施方式中，所述与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的疾病包括纤维化疾病；所述纤维化疾病包括肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化、心肌纤维化等。

38、第九方面，本发明提供了一种靶向成纤维细胞活化蛋白的分子探针，所述分子探针包括含有如上所述的单克隆抗体和/或单链抗体；所述单克隆抗体和/或单链抗体上引入有化学、生物或物理系统中可探测的示踪物质。

39、在本发明的一种实施方式中，所述示踪物质包括放射性核素、荧光物质和/或磁性物质。

40、在本发明的一种实施方式中，所述分子探针用于检测与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的病灶。

41、在本发明的一种实施方式中，所述与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的病灶包括纤维化组织；所述纤维化组织包括纤维化肝组织、纤维化肺组织、肾纤维化肾组织、心肌纤维化心肌组织等。

42、第十方面，本发明提供了如上所述的单克隆抗体或单链抗体或嵌合抗原受体或多特异性抗体或核酸分子或重组质粒或工程化细胞在制备靶向成纤维细胞活化蛋白的药物或靶向成纤维细胞活化蛋白的分子探针中的应用。

43、在本发明的一种实施方式中，所述药物用于预防和/或治疗与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的疾病。

44、在本发明的一种实施方式中，所述与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的疾病包括纤维化疾病；所述纤维化疾病包括肝纤维化、肺纤维化、肾纤维化和/或心肌纤维化。

45、在本发明的一种实施方式中，所述分子探针用于检测与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的病灶。

46、在本发明的一种实施方式中，所述与成纤维细胞活化蛋白的表达相关的病灶包括纤维化组织；所述纤维化组织包括纤维化肝组织、纤维化肺组织、肾纤维化和/或心肌纤维化。

47、本发明技术方案，具有如下优点：

48、1、本发明提供了一种靶向成纤维细胞活化蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.4或seqid no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.8所示的cdr3，轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6或seq id no.7所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.9或seq id no.10所示的cdr3。研究表明，所述单克隆抗体对成纤维细胞活化蛋白具有较强的亲和力和结合活性，且对成纤维细胞活化蛋白阳性细胞具有较强的结合活性和特异性识别能力，此外，采用所述单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区构建的car-t细胞，在体外对成纤维细胞活化蛋白阳性细胞具有显著的杀伤效果。因此，所述单克隆抗体在成纤维细胞活化蛋白靶向药物或分子探针的制备中极具应用前景。

49、2、本发明提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞表达嵌合抗原受体；所述嵌合抗原受体包括car本体结构单元；所述car本体结构单元包括依次相连的靶向成纤维细胞活化蛋白的胞外识别域、胞外间隔区、跨膜区、胞内共刺激结构域以及胞内信号转导结构域；所述胞外识别域包括依次相连的信号肽以及单链抗体；所述单链抗体包括单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区；所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如seq id no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.4或seq id no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq idno.8所示的cdr3，轻链可变区包括氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.3所示的cdr1、氨基酸序列如seq id no.6或seq id no.7所示的cdr2和氨基酸序列如seq id no.9或seqid no.10所示的cdr3。研究表明，所述工程化细胞能够特异性靶向成纤维细胞活化蛋白阳性并对其造成杀伤，因此，所述工程化细胞在成纤维细胞活化蛋白靶向药物的制备中极具应用前景。