一种箭筈豌豆6KSNP液相分型芯片及其应用

本发明属于植物液相芯片，具体涉及一种用于箭筈豌豆6k snp液相分型芯片及其应用。

背景技术：

1、箭筈豌豆（

vicia sativa l.）是一种重要的一年生豆科牧草和绿肥作物，具有适应性广、饲用价值较高和固氮能力强等特点，在饲草生产、草田轮作及农业生态系统中具有重要应用价值。随着箭筈豌豆种质资源收集、评价及新品种选育工作的不断开展，对不同种质材料进行准确鉴定、遗传多样性评价和优良育种材料高效筛选的需求日益增加。

2、传统的箭筈豌豆种质资源鉴定和育种选择主要依赖形态学性状及田间表型。形态学性状容易受到生育时期、栽培环境和调查条件等因素影响，对于遗传背景相近或者表型相似的材料，仅依靠表型往往难以进行快速、准确区分。同时，单株干重、百粒重等重要农艺性状通常受到遗传因素与环境因素共同影响，采用传统田间表型鉴定需要在特定生育时期甚至植株成熟后进行测定，育种材料筛选周期较长、工作量较大。因此，建立基于基因组信息的高通量分子检测体系，对于箭筈豌豆种质资源评价和分子育种具有重要意义。

3、snp（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）是植物基因组中广泛存在的一类遗传变异。利用高密度snp标记能够获得不同种质材料的基因组遗传差异信息，可应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析、品种鉴定、遗传背景分析及分子标记辅助育种等领域。与逐个位点开展低通量分型相比，基于液相靶向捕获技术构建snp分型芯片，可对大量目标snp位点进行集中检测，适用于大批量种质材料的高通量基因型分析。

4、目前，箭筈豌豆可用于高通量检测的标准化snp标记体系仍相对有限，尤其缺乏覆盖基因组不同区域、同时兼顾全基因组遗传背景检测和重要农艺性状辅助选择的高密度snp液相分型平台。仅获得大规模snp基因型信息虽然能够用于种质资源遗传分析，但如果缺乏与具体农艺性状之间的对应关系，则难以直接用于目标性状育种材料的定向选择。

5、因此，有必要在建立覆盖箭筈豌豆基因组的高密度snp分型体系基础上，将能够反映种质遗传背景的背景snp位点与具有育种应用价值的前景snp位点相结合，构建兼顾高通量基因型检测和分子辅助选择功能的snp液相分型芯片。同时，在高密度基因型数据基础上进一步鉴定并验证与重要农艺性状相关的snp位点，可使所构建的snp芯片由一般性的基因型检测工具进一步拓展为育种材料辅助选择工具。其中，单株干重和百粒重分别反映箭筈豌豆的生物量和种子产量相关特征，是本发明进一步开展分子标记辅助选择验证的重要农艺性状。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种覆盖箭筈豌豆基因组、位点数量约为6k、检测稳定，并兼具高通量基因分型和重要农艺性状辅助选择功能的snp液相分型芯片及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、基于222份箭筈豌豆种质资源的全基因组重测序数据，系统检测snp变异；结合snp位点的最小等位基因频率、缺失率及杂合率进行筛选；采用前景snp位点和背景snp位点相结合的策略，构建约6k数量级的snp位点集合；依据液相捕获探针设计原则，构建箭筈豌豆6k snp液相分型芯片。

4、所述液相分型芯片包括用于检测箭筈豌豆snp位点组合的探针集合，所述snp位点组合对应6010个snp分子标记，其中前景snp位点262个，背景snp位点5748个，所述snp位点的具体信息如表1所示：

5、表1 箭筈豌豆6k snp液相芯片位点中的6010个位点信息

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21、优选地，所述snp位点的筛选标准包括：最小等位基因频率（minor allelefrequency，maf）≥0.35，缺失率＜0.1，杂合率＜0.1。

22、优选地，所述snp位点包括前景snp位点和背景snp位点，其中前景snp位点为262个，背景snp位点为5748个。

23、优选地，用于检测所述snp位点的液相捕获探针长度为110 bp，探针序列的gc含量为30%–70%。

24、本发明还公开了一种上述箭筈豌豆6k snp液相分型芯片的构建方法，包括如下步骤：

25、（1）获取箭筈豌豆种质材料并进行全基因组重测序；

26、（2）对重测序数据进行质量控制，并将质量控制后的测序数据与箭筈豌豆参考基因组studenica进行序列比对，进行snp变异检测和基因型调用；

27、（3）根据最小等位基因频率、缺失率和杂合率对检测得到的snp位点进行质量控制筛选；

28、（4）结合前景snp位点和背景snp位点的选择以及snp位点在箭筈豌豆基因组中的分布情况，确定用于芯片构建的候选snp位点；

29、（5）针对所述候选snp位点设计液相捕获探针，并根据探针设计结果进一步筛选目标snp位点，构建箭筈豌豆6k snp液相分型芯片。

30、其中，步骤（3）中snp位点的筛选标准包括：maf≥0.35、缺失率<0.1、杂合率<0.1。

31、其中，步骤（5）中用于检测目标snp位点的液相捕获探针长度为110 bp，探针gc含量为30%-70%。

32、本发明还公开了一种利用上述箭筈豌豆6k snp液相分型芯片进行箭筈豌豆基因分型的方法，包括提取待检测箭筈豌豆材料的基因组dna、利用液相捕获探针对目标区域进行捕获、高通量测序以及snp基因型检测，从而获得待检测箭筈豌豆材料的snp基因型数据。

33、基于上述基因分型的方法，本发明还保护一种箭筈豌豆的分子辅助育种方法，包括如下步骤：

34、（1）利用所述的箭筈豌豆6k snp液相分型芯片对待测箭筈豌豆的dna进行检测，获得待测样本的snp基因型数据；

35、（2）根据所得基因型数据筛选得到符合育种目标的箭筈豌豆个体。

36、本发明还保护上述箭筈豌豆6k snp液相分型芯片在以下任一项中的应用：

37、（1）箭筈豌豆种质资源基因型鉴定及遗传分析；

38、（2）箭筈豌豆分子标记辅助育种；

39、（3）箭筈豌豆优良育种材料筛选。

40、其中一个较佳的实施方式为：所述6k snp液相分型芯片用于鉴定与箭筈豌豆单株干重和/或百粒重相关的snp位点。

41、所述与箭筈豌豆单株干重相关的snp位点包括chr2_281381719和chr3_289425090；所述与箭筈豌豆百粒重相关的snp位点包括chr4_110073746和chr5_179799380。

42、其中：

43、chr2_281381719位于箭筈豌豆第2号染色体281381719 bp位置，该位点的等位变异为g/a，与箭筈豌豆单株干重显著相关；

44、chr3_289425090位于箭筈豌豆第3号染色体289425090 bp位置，该位点的等位变异为a/g，与箭筈豌豆单株干重显著相关；

45、chr4_110073746位于箭筈豌豆第4号染色体110073746 bp位置，该位点的等位变异为a/t，与箭筈豌豆百粒重显著相关；

46、chr5_179799380位于箭筈豌豆第5号染色体179799380 bp位置，该位点的等位变异为a/g，与箭筈豌豆百粒重显著相关。

47、上述染色体物理位置均以studenica箭筈豌豆参考基因组为参考。利用上述snp位点，可对箭筈豌豆单株干重和/或百粒重性状进行分子辅助筛选。

48、更加具体地，当以单株干重为筛选目标时，检测chr2_281381719和/或chr3_289425090位点。其中，chr2_281381719位点的a等位基因为优选等位基因，aa基因型材料的单株干重显著高于gg基因型材料；chr3_289425090位点的g等位基因为优选等位基因，gg基因型材料的单株干重显著高于aa基因型材料。因此，优选选择chr2_281381719位点为aa基因型和/或chr3_289425090位点为gg基因型的材料。

49、进一步优选地，同时检测chr2_281381719和chr3_289425090位点，并优先选择chr2_281381719/chr3_289425090联合基因型为aa/gg的箭筈豌豆材料。

50、当以百粒重为筛选目标时，检测chr4_110073746和/或chr5_179799380位点。其中，chr4_110073746位点的a等位基因为优选等位基因，aa基因型材料的百粒重显著高于tt基因型材料；chr5_179799380位点的a等位基因为优选等位基因，aa基因型材料的百粒重显著高于gg基因型材料。因此，优选选择chr4_110073746位点为aa基因型和/或chr5_179799380位点为aa基因型的材料。

51、进一步优选地，同时检测chr4_110073746和chr5_179799380位点，并优先选择chr4_110073746/chr5_179799380联合基因型为aa/aa的箭筈豌豆材料。

52、上述优选基因型与实施例4、实施例5中的验证结果一致：chr2_281381719的aa基因型和chr3_289425090的gg基因型与较高单株干重相关；chr4_110073746和chr5_179799380的aa基因型与较高百粒重相关。

53、因此，上述snp位点可作为箭筈豌豆单株干重和百粒重性状分子辅助选择的标记。

54、本发明还公开了一种箭筈豌豆单株干重和/或百粒重性状的分子辅助筛选方法，包括如下步骤：

55、（1）提取待筛选箭筈豌豆材料的基因组dna；

56、（2）利用上述箭筈豌豆6k snp液相分型芯片对待筛选箭筈豌豆材料进行基因分型；

57、（3）获得chr2_281381719、chr3_289425090、chr4_110073746和/或chr5_179799380位点的基因型；

58、（4）根据所得snp位点的基因型以及相应的育种目标，对待筛选箭筈豌豆材料进行辅助选择。

59、当以单株干重为筛选目标时，优选chr2_281381719位点为aa基因型和/或chr3_289425090位点为gg基因型的材料；进一步优选chr2_281381719/chr3_289425090联合基因型为aa/gg的材料。

60、当以百粒重为筛选目标时，优选chr4_110073746位点为aa基因型和/或chr5_179799380位点为aa基因型的材料；进一步优选chr4_110073746/chr5_179799380联合基因型为aa/aa的材料。

61、通过上述方法，可在育种材料的基因型检测阶段对具有较高单株干重潜力和/或较高百粒重潜力的箭筈豌豆材料进行辅助筛选，并根据筛选结果确定进入后续田间表型鉴定的候选材料，从而提高目标育种材料的筛选效率。

62、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

63、（1）本发明构建了一套包含6010个snp位点的箭筈豌豆6k snp液相分型芯片，其中包括262个前景snp位点和5748个背景snp位点。所述snp位点经最小等位基因频率、缺失率和杂合率等条件筛选，并分布于箭筈豌豆不同染色体和基因组区域，可获得箭筈豌豆种质材料较为丰富的全基因组snp基因型信息，为种质资源鉴定、遗传多样性分析、品种鉴定、遗传背景分析及分子育种提供统一的高通量基因分型平台。

64、（2）本发明针对筛选获得的snp位点设计液相捕获探针，探针长度为110 bp，gc含量控制在30%-70%。采用本发明所述6k snp液相分型芯片对205份独立箭筈豌豆种质材料进行检测，各样品snp位点检出率介于89.50%-98.74%之间，平均检出率为97.08%，表明所述芯片能够较稳定地获得不同箭筈豌豆种质材料的snp基因型数据，具有良好的检测性能。

65、（3）在利用本发明芯片获得群体基因型数据的基础上，本发明进一步鉴定获得4个与箭筈豌豆重要农艺性状显著相关的snp位点。其中，chr2_281381719和chr3_289425090与单株干重显著相关，chr4_110073746和chr5_179799380与百粒重显著相关，并确定了相应性状的优选基因型，从而使所述芯片获得的基因型信息能够进一步用于目标农艺性状的分子辅助选择。

66、（4）本发明将用于表征箭筈豌豆全基因组遗传背景的背景snp位点与具有育种应用价值的前景snp位点整合于同一检测体系中，使一套芯片既能够用于箭筈豌豆种质资源的高通量基因型分析，又能够根据目标性状相关snp位点对育种材料进行辅助筛选。通过在育种早期获取基因型信息，可对候选材料进行预筛选，减少后续需要进行大规模田间表型鉴定的材料数量，提高优良育种材料的筛选效率。