高性能辣根过氧化物酶突变体、编码基因、重组质粒及其应用

本发明涉及酶工程，特别涉及一种高性能辣根过氧化物酶突变体、编码基因、重组质粒及其应用。

背景技术：

1、辣根过氧化物酶（hrp，ec 1.11.1.7）是一类源自辣根植物的经典分泌型植物过氧化物酶。由于其具有卓越的生物稳定性、优良的水溶性及较高的催化效率，hrp已成为生物医学分析与环境治理领域不可或缺的核心工具酶。在临床诊断中，hrp常作为信号放大系统的关键组分，广泛应用于酶联免疫吸附试验（elisa）、组织化学示踪及酶介导的肿瘤前药治疗等；在工业与环境领域，hrp在食品加工、酚类废水降解等方面也展现出巨大的应用价值。

2、随着精准医疗与即时检测（poct）的飞速发展，超灵敏检测技术对hrp的催化性能提出了更高要求。10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪（adhp）作为一种高灵敏度的过氧化氢荧光底物，其催化转化速率直接决定了分析方法的灵敏度、检测限及响应时间。现有技术中，野生型hrp在处理痕量样本时常面临信号增益不足、反应周期较长等局限。因此，通过蛋白质工程或定向进化技术，针对hrp的活性位点或底物结合通道进行理性设计与改良，以提升其对adhp的催化周转数和亲和力，不仅有助于降低酶制剂成本、缩短高通量筛选时间，更对阐明酶-底物相互作用机制、推动高性能生物传感器的开发具有深远意义。

3、专利cn120005845b高催化活性的辣根过氧化物酶突变体其构建方法及应用，通过定点突变技术将来源于辣根植物的辣根过氧化物酶（pdb：1hch）氨基酸序列的第40位组氨酸突变为色氨酸，获得的突变体（h40w）催化过氧化氢和adhp生成试卤灵的活性显著高于野生型，但其提升幅度有限（3倍），有必要进一步进行改性，以获得活性更高的辣根过氧化物酶突变体。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种高性能辣根过氧化物酶突变体、编码基因、重组质粒及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种高性能辣根过氧化物酶突变体，其通过将如seq id no.1所示的野生型辣根过氧化物酶的氨基酸序列按如下方式进行突变得到：第134位丙氨酸突变为缬氨酸、第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸。

3、优选的是，其通过将如seq id no.1所示的辣根过氧化物酶的氨基酸序列按如下（1）-（3）中的任意一种方式进行突变得到：

4、（1）第135位天冬酰胺突变为脯氨酸，得到的突变体记为n135p；

5、（2）第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，得到的突变体记为n135p/f143m；

6、（3）第134位丙氨酸突变为缬氨酸、第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，得到的突变体记为a134v/n135p/f143m。

7、本发明的第二方面，提供编码如上所述的高性能辣根过氧化物酶突变体的基因。

8、优选的是，编码如seq id no.1所示的野生型辣根过氧化物酶的核苷酸序列为seqid no.3，编码所述高性能辣根过氧化物酶突变体的基因均是基于seq id no.3所示的核苷酸序列进行定点突变获得的。

9、优选的是，突变体a134v/n135p/f143m、n135p、n135p/f143m的序列依次为seq idno.2、seq id no.5、seq id no.7。

10、优选的是，编码如seq id no.2所示的高性能辣根过氧化物酶突变体的核苷酸序列为seq id no.4；

11、编码如seq id no.5所示的高性能辣根过氧化物酶突变体的核苷酸序列为seq idno.6；

12、编码如seq id no.7所示的高性能辣根过氧化物酶突变体的核苷酸序列为seq idno.8。

13、本发明的第三方面，提供一种包含如上所述的基因的重组质粒。

14、本发明的第四方面，提供一种包含如上所述的基因或是重组质粒的宿主细胞。

15、优选的是，所述宿主细胞为携带如上所述重组质粒的酿酒酵母eby100。

16、本发明的第五方面，提供一种如上所述的高性能辣根过氧化物酶突变体在催化过氧化氢和adhp生成试卤灵中的应用。

17、本发明的有益效果是：

18、本发明以来源于辣根植物的辣根过氧化物酶（pdb：1hch）为模板，通过定点突变将其氨基酸序列中第134位丙氨酸突变为脯氨酸，得到突变体n135p；第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，得到突变体n135p/f143m；第134位丙氨酸突变为缬氨酸、第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸，得到突变体a134v/n135p/f143m。实验数据表明，在以10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪（adhp）为底物的催化体系中，相较于野生hrp（hrpwt），上述三种该突变体的催化效率与反应速率较野生型酶均有显著提升，能够大幅增加荧光产物试卤灵的生成强度；而其中a134v/n135p/f143m突变体的活性提升幅度最大，达到了120倍。本发明获得的变体性能优异，可利用常规重组表达系统高效制备，在高性能生化诊断试剂开发、生物传感及高灵敏度检测等领域具有极高的商业应用价值。

1. 一种高性能辣根过氧化物酶突变体，其特征在于，其通过将如seq id no.1所示的野生型辣根过氧化物酶的氨基酸序列按如下方式进行突变得到：第134位丙氨酸突变为缬氨酸、第135位天冬酰胺突变为脯氨酸且第143位苯丙氨酸突变为甲硫氨酸。

2. 根据权利要求1所述的高性能辣根过氧化物酶突变体，其特征在于，其通过将如seqid no.1所示的辣根过氧化物酶的氨基酸序列按如下（1）-（3）中的任意一种方式进行突变得到：

3.编码权利要求1或2所述的高性能辣根过氧化物酶突变体的基因。

4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码如seq id no.1所示的野生型辣根过氧化物酶的核苷酸序列为seq id no.3，编码所述高性能辣根过氧化物酶突变体的基因均是基于seq id no.3所示的核苷酸序列进行定点突变获得的。

5. 根据权利要求4所述的基因，其特征在于，突变体a134v/n135p/f143m、n135p、n135p/f143m的序列依次为seq id no.2、seq id no.5、seq id no.7。

6. 根据权利要求5所述的基因，其特征在于，编码如seq id no.2所示的高性能辣根过氧化物酶突变体的核苷酸序列为seq id no.4；

7.一种包含如权利要求3-6中任意一项所述的基因的重组质粒。

8.一种包含如权利要求3-6中任意一项所述的基因或是权利要求7所述的重组质粒的宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为携带如权利要求7所述重组质粒的酿酒酵母eby100。

10.一种如权利要求1或2所述的高性能辣根过氧化物酶突变体在催化过氧化氢和adhp生成试卤灵中的应用。