灰飞虱发育关键基因LsHPL1及其在生物防治中的应用

本发明属于农业昆虫与害虫防治，涉及一种灰飞虱发育关键基因lshpl1及其双链rna在农业害虫绿色防控中的应用，适用于水稻飞虱类害虫的rna干扰生物防治。

背景技术：

1、灰飞虱（laodelphax striatellus），是一种跨区域分布的刺吸式植食性农业害虫。该虫以水稻韧皮部筛管汁液为主要食源，通过口针穿刺植物组织并分泌唾液建立取食通道，寄主范围广泛，核心寄主涵盖水稻、小麦、玉米、高粱等禾本科粮食作物，并具有明确的季节性寄主偏好——华东、华中地区越冬寄主以麦类、稗草为主，夏季寄主则以水稻、玉米为主。在稻麦轮作区表现出显著的寄主转换特性，为其种群周年增殖提供了连续的生态位保障。高密度种群可直接导致植株基部叶片黄化、茎秆矮缩，形成典型的"虱烧"症状，严重时整株枯死；同时，灰飞虱取食过程中分泌大量蜜露，诱发煤污病，阻碍叶片光合作用，进一步加剧产量损失。

2、灰飞虱最大的危害在于其作为多种植物病毒的高效传播媒介。该虫以持久增殖型方式传播水稻条纹病毒（rice stripe virus, rsv）、水稻黑条矮缩病毒（rice black-streaked dwarf virus, rbsdv）、玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus, mrdv）、大麦黄条花叶病毒（barley yellow striate mosaic virus, bysmv）等多种病毒。灰飞虱传播病毒具有如下特点：病毒进入虫体后需经过中肠感染、血淋巴扩散及唾液腺释放等组织的循回增殖过程，1-2龄若虫获毒效率最高，但成虫传毒能力最强，最短获毒饲毒时间仅需5-30分钟；一旦获毒，灰飞虱可终身带毒传毒，并可通过卵将病毒垂直传播给后代，带毒率可高达84%。这种水平传播与垂直传播并存的双重传播途径，加之灰飞虱世代周期短（年发生5-10代）、繁殖力强，使得上述病毒病极易流行成灾，对水稻安全生产构成严重威胁。

3、长期以来，灰飞虱的防治以化学农药为主，化学药剂连续单一长期使用已导致灰飞虱对多种农药产生了不同程度的抗性。因此，在实际生产中，亟需化学农药之外的绿色防治手段。随着生物技术的发展，运用生物学手段进行害虫防治已经成为植物保护的重要方向。其中，rna干扰（rna interference, rnai）是由双链rna（double-stranded rna,dsrna）介导的转录后基因沉默机制，是挖掘基因功能的现代分子工具。

4、包括昆虫在内的所有需氧生物在各种胁迫环境下可快速产生活性氧并启动适应性应答，但活性氧过量积累会诱发氧化应激，造成 dna 损伤与细胞毒害。昆虫已进化出一类过氧化物酶蛋白，通过催化过氧化氢等过氧化物还原，清除过量活性氧，进而缓解氧化损伤、维持胞内氧化稳态。昆虫中的过氧化物酶可分为几种不同的类型，包括血红素过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶以及硫氧还蛋白/谷胱甘肽过氧化物酶。在这些类型中，血红素过氧化物酶（heme peroxidase, hpl）是一个重要的类群，昆虫血红素过氧化物酶hpls以血红素为辅基的核心抗氧化酶，通过清除胞内过量活性氧、维持机体氧化还原平衡，广泛介导其生长发育与生殖生理调控。本发明围绕灰飞虱lshpl1基因开展研究，发现该基因沉默后可导致灰飞虱死亡、雌虫的卵巢发育受损，并抑制水稻条纹病毒在灰飞虱体内的侵染。为治理灰飞虱及其病毒病害防控提供潜在靶标基因。

技术实现思路

1、本发明属于农业昆虫与害虫防治技术领域，提供了一种灰飞虱发育关键基因血红素过氧化物酶基因lshpl1的dsrna及应用。所述灰飞虱血红素过氧化物酶基因的序列如seqid no.1所示。本发明筛选获得灰飞虱发育关键基因—血红素过氧化物酶基因lshpl1，利用该基因的双链rna（dsrna）对灰飞虱进行注射，可有效沉默靶标基因；基因沉默会导致灰飞虱死亡和雌虫的卵巢发育受损。本发明所提供的dsrna靶向性强、环境安全性高，为基于rna干扰技术的灰飞虱绿色防控提供了新的分子靶标与应用途径。

2、为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了lshpl1基因作为灰飞虱防治的靶标基因的用途，所述lshpl1基因包含如seq id no.1所示的核苷酸序列。

4、本发明通过转录组学发现lshpl1在灰飞虱每个龄期蜕皮发育关键阶段特异性高表达，表明该基因深度参与灰飞虱蜕皮与生长发育进程。

5、另一方面，本发明提供了一种靶向灰飞虱发育基因lshpl1的dsrna，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述灰飞虱发育基因lshpl1的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、进一步地，所述灰飞虱发育关键基因lshpl1编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

7、另一方面，本发明提供了一种用于扩增上述dsrna的一对引物组，如seq id no.5和seq id no.6所示。

8、另一方面，本发明提供了一种用于检测上述dsrna的干扰效率的一对定量pcr引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示。

9、另一方面，本发明提供了所述dsrna在制备用于杀死灰飞虱的生物制剂中的应用。

10、另一方面，本发明提供了所述dsrna在制备用于抑制灰飞虱雌虫卵巢发育的制剂中的应用。

11、作为上述应用的一种优选方案，所述灰飞虱为成虫和/或若虫。

12、另一方面，本发明提供了一种用于防治灰飞虱的生物制剂，其活性成分包含上述的dsrna。

13、进一步地，所述生物制剂用于杀死灰飞虱和/或抑制灰飞虱雌虫卵巢发育。

14、本发明的有益效果为：

15、1、本发明通过将获得的lshpl1基因的dsrna导入灰飞虱后，干扰灰飞虱发育基因lshpl1表达，致使其生理状态失衡、生长发育受阻，并引起灰飞虱死亡，同时影响雌虫卵巢发育；

16、2、本发明通过生物学手段进行灰飞虱防治，具有高度的靶标特异性，安全性高，对环境生态和食品都安全无害，为灰飞虱绿色防控提供新策略。

1.lshpl1基因用作rna干扰防治灰飞虱的靶标基因的用途，其特征在于，所述rna干扰通过向灰飞虱注入靶向lshpl1基因的dsrna实现，所述lshpl1基因包含seq id no.1所示的核苷酸序列，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no.9所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的防治包括杀死灰飞虱。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的防治包括抑制灰飞虱雌虫卵巢发育。

4.一种靶向灰飞虱发育基因lshpl1的dsrna，其特征在于，所述dsrna的核苷酸序列如seq id no.9所示。

5.根据权利要求4所述的一种靶向灰飞虱发育基因lshpl1的dsrna，其特征在于，还包括用于扩增所述dsrna的一对引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示。

6.根据权利要求5所述的一种靶向灰飞虱发育基因lshpl1的dsrna，其特征在于，还包括用于检测所述dsrna对灰飞虱防治靶标基因的干扰效率的一对定量pcr引物，所述引物的核苷酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示。

7.根据权利要求6所述的一种靶向灰飞虱发育基因lshpl1的dsrna，其特征在于，所述灰飞虱为成虫和/或若虫。

8.一种灰飞虱发育基因lshpl1，其特征在于，所述lshpl1基因包含seq id no.1所示的核苷酸序列。