一种富氮树脂及其制备方法与在分离纯化橄榄苦苷中的应用

本发明属于天然产物分离材料制备应用，具体涉及一种富氮树脂的制备及其在分离制备高纯度橄榄苦苷中的应用。

背景技术：

1、油橄榄（

olea europaea l.）种植过程会产生大量副产物油橄榄叶，每年产生规模巨大，多数直接丢弃或焚烧，资源浪费严重且带来环境压力。油橄榄叶中含有丰富的裂环烯醚萜、黄酮类多酚物质，其中橄榄苦苷（oleuropein）是核心活性成分，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、神经保护等多种药理活性，在医药、保健食品、化妆品领域具备很高开发价值。橄榄苦苷化学性质不稳定，原料中内源糖苷酶可催化其发生酶解，受热、酸碱条件下也易降解，给分离纯化工艺带来较大挑战。

2、目前，橄榄苦苷的分离纯化方法主要有有机溶剂萃取法、大孔树脂吸附色谱法、高速逆流色谱法以及制备型液相色谱法等。其中，大孔吸附树脂因操作简便、成本相对较低，是目前应用最广泛的橄榄苦苷富集手段。例如，d-101型大孔树脂常用于橄榄叶提取物中橄榄苦苷的富集，ab-8型树脂对橄榄苦苷也表现出一定的选择性吸附能力。然而，常规大孔树脂对橄榄苦苷的吸附选择性有限，通常仅能将橄榄苦苷含量富集至45%左右，难以满足高纯度产品的制备需求。

3、为获得更高纯度的橄榄苦苷，现有技术多采用多步色谱联用的策略。专利cn202311780579.3公开了多步色谱联用纯化方法，粗提物依次经过大孔树脂、凝胶柱、ods中压柱多级色谱处理，可以得到纯度大于98%的橄榄苦苷；该方法产物纯度高，但需要多次色谱上样，溶剂消耗量巨大，凝胶与ods填料成本昂贵，放大生产的经济性较差，仅适合实验室小规模制备。专利cn202410400346.4公开了大孔树脂-制备液相联用同步制备橄榄苦苷和木犀草苷的工艺，大孔树脂先将橄榄苦苷富集至45%以上，再经制备液相进一步提纯得到90%以上纯度产物；该方法可以同时回收两种活性成分、收率较高，但大孔树脂仅作为粗富集单元，高纯度产物高度依赖制备液相，填料与溶剂消耗大，处理规模受限，大规模工业化生产成本偏高。

4、此外，也有研究者尝试采用阴离子树脂（lx-68m）分离纯化橄榄苦苷，结果表明橄榄苦苷的吸附率、解吸率分别为86.86%、87.08%，但纯化后纯度仅为52.33%。膜分离耦合技术也被应用于橄榄苦苷的纯化，但所得产品纯度通常仅能达到50%左右，且收率较低、单位生产成本高。可见，现有分离纯化技术普遍存在工艺路线长、设备成本高、有机溶剂消耗大、处理规模受限等问题，难以同时满足高纯度、高得率和低成本规模化生产的要求。

5、因此，本领域亟需开发一种制备工艺简单、成本低廉、对橄榄苦苷吸附选择性好且易于规模化生产的分离材料及纯化方法，以解决现有技术中橄榄苦苷纯化工艺复杂、成本高、纯度与得率难以兼顾的技术问题。

技术实现思路

1、本发明提供了一种富氮树脂及其制备方法与应用，其目的在于克服现有大孔树脂在分离纯化橄榄苦苷时吸附量低、纯化后橄榄苦苷含量不足的技术缺陷，提供一种对橄榄苦苷具有高吸附容量和高选择性的新型树脂材料及其制备方法，以及将该树脂用于从油橄榄叶提取液中一步分离制备高含量橄榄苦苷的工艺。

2、为实现上述发明目的，本发明提供了一种富氮树脂的制备方法，该方法以含氯甲基（-ch2cl）活性位点的聚苯乙烯系树脂为基体，通过“聚乙烯亚胺接枝-二卤代烃交联-二次聚乙烯亚胺接枝”的三步连续修饰策略，在树脂骨架表面构建高密度富氮交联网络结构。具体步骤如下：

3、（1）将氯甲基化聚苯乙烯系树脂置于醇类水溶液中进行溶胀处理。所述氯甲基化树脂既可采用市售商品化氯甲基树脂（如氯甲基化聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物树脂），也可通过对普通聚苯乙烯系大孔吸附树脂（如d101、bmkx-4等）进行傅-克氯甲基化反应自行制备。所述醇类水溶液优选为甲醇水溶液或乙醇水溶液，其浓度可根据树脂的极性和溶胀性能进行调整。溶胀处理的目的是使树脂微球的内部孔道充分打开，为后续化学修饰反应提供良好的可及性。

4、（2）将步骤一所得溶胀后的氯甲基化树脂与第一份聚乙烯亚胺（pei）混合，在搅拌条件下进行接枝反应。聚乙烯亚胺是一种含有大量伯胺、仲胺和叔胺基团的水溶性高分子，其分子链上的氨基可与树脂表面的氯甲基（-ch2cl）发生亲核取代反应（胺烷基化反应），形成c-n共价键，从而将聚乙烯亚胺牢固地键合于树脂骨架表面。反应体系中，聚乙烯亚胺与氯甲基化树脂的质量比控制在1：（1~10）的范围内，反应温度为40~80℃，反应时间为4~24小时，搅拌转速为50~200 rpm。反应结束后，过滤收集树脂，依次用水和乙醇反复洗涤，以除去未反应的游离聚乙烯亚胺及其他杂质，得到一次胺基修饰树脂（即“树脂1”）。

5、该步骤中聚乙烯亚胺的分子量可根据实际需要选择，优选为分子量600~10000的支化聚乙烯亚胺，更优选为分子量1200~1800的支化聚乙烯亚胺。

6、（3）将步骤二所得的一次胺基修饰树脂转移至反应容器中，加入非质子有机溶剂进行溶胀处理。然后加入二卤代烃，在搅拌条件下进行交联反应。该步骤的核心技术原理在于：已接枝于树脂表面的聚乙烯亚胺分子链上含有大量未反应的氨基（尤其是伯胺基），二卤代烃（如二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等）分子两端的卤素原子可分别与不同聚乙烯亚胺分子链上的氨基发生亲核取代反应，在相邻的聚乙烯亚胺链之间形成“桥联”结构，从而将线性接枝的聚乙烯亚胺分子链转化为三维交联网络。该交联结构具有以下三重作用：①提高树脂的机械强度和化学稳定性；②防止聚乙烯亚胺链在后续使用过程中的溶胀流失；③增加树脂表面的胺基密度和比表面积。

7、所述非质子有机溶剂选自甲苯、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷或n,n-二甲基甲酰胺（dmf），优选为甲苯或二氯甲烷。所述二卤代烃选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、1,2-二溴乙烷、1,4-二氯丁烷、1,4-二溴丁烷或1,4-对二苄氯，优选为二氯甲烷或1,2-二氯乙烷。二卤代烃与一次胺基修饰树脂的质量比控制在1：（1~10）的范围内，交联反应温度为40~80℃，反应时间为4~24小时，搅拌转速为50~200 rpm。反应结束后，过滤收集树脂，依次用水和乙醇反复洗涤，得到交联树脂（即“树脂2”）。

8、（4）将步骤三所得的交联树脂置于醇类水溶液中进行溶胀处理，然后加入第二份聚乙烯亚胺进行二次接枝反应。该步骤的技术原理在于：经步骤三交联反应后，树脂中仍可能存在部分未参与反应的残余氯甲基（-ch2cl）或其他含卤素活性位点，利用第二份聚乙烯亚胺再次进行亲核取代反应，可进一步将这些残余活性位点转化为胺基，从而最大限度地提高树脂表面的胺基密度（即“氮含量”）。更重要的是，二次接枝的聚乙烯亚胺不仅填充了交联网络中可能存在的孔隙缺陷，还进一步丰富了树脂表面的胺基种类和数量，显著增强了对橄榄苦苷等多酚类化合物的氢键结合能力。

9、所述醇类水溶液为甲醇水溶液或乙醇水溶液。第二份聚乙烯亚胺与交联树脂的质量比控制在1：（1~10）的范围内，二次接枝反应温度为40~80℃，反应时间为4~24小时，搅拌转速为50~200 rpm。反应结束后，过滤收集树脂，依次用水和乙醇反复洗涤，真空干燥后即得富氮树脂成品。

10、本发明还提供上述富氮树脂在分离纯化橄榄苦苷中的应用。

11、将上述制备的富氮树脂用于从油橄榄叶提取液中分离纯化橄榄苦苷。具体包括以下操作：

12、（1）油橄榄叶提取液的制备：以水为提取溶剂提取油橄榄叶中的活性成分，提取液经浓缩后备用。提取方式可采用加热回流提取、超声辅助提取或渗漉提取等本领域常规方法。

13、（2）静态吸附：将富氮树脂与油橄榄叶浓缩提取液按质量体积比1：（2~20）的比例混合（单位：g/ml），在搅拌条件下进行静态吸附。吸附条件为：转速50~300 r/min，温度10~50℃，吸附时间1~20小时。在吸附过程中，橄榄苦苷分子通过氢键作用、静电相互作用及范德华力等多重协同作用被选择性地富集于富氮树脂表面。

14、（3）解吸附：吸附结束后，过滤分离树脂，加入体积分数10%~100%的甲醇水溶液或乙醇水溶液进行解吸附。解吸附条件为：转速50~300 r/min，温度10~50℃，解吸附时间1~20小时。在高浓度有机溶剂条件下，橄榄苦苷与树脂之间的氢键作用被削弱，橄榄苦苷从树脂上被洗脱进入解吸液中。

15、（4）重复操作：根据需要，可重复上述吸附-解吸附循环1~5次，将多次解吸液合并，经浓缩干燥即得高含量橄榄苦苷产品。

16、本发明实现上述技术效果的原理可从材料设计和分离机制两个层面加以阐述：

17、从材料设计层面看：本发明采用“接枝-交联-二次接枝”的三步策略，其核心创新在于充分利用聚乙烯亚胺（pei）这一富含胺基的高分子作为功能单元。第一步接枝在树脂骨架表面引入密集的胺基“锚点”；第二步交联通过二卤代烃的桥联作用将离散的pei链编织为三维网络，既提高了功能层的稳定性，又增大了有效比表面积；第三步二次接枝则利用残余活性位点进一步负载pei，实现胺基密度的“饱和化”。该三步策略的协同效应在于：最终形成的富氮层具有极高的胺基含量（氮元素重量百分比可达10%~20%），远高于常规单步修饰树脂。

18、从分离机制层面看：橄榄苦苷分子中含有多个酚羟基和糖苷键，是一种富含氢键供体和受体的极性分子。本发明树脂表面高密度的胺基（包括伯胺、仲胺和叔胺）可作为优异的氢键供体和受体，与橄榄苦苷分子之间形成多位点氢键作用，从而实现高选择性吸附。同时，树脂骨架的疏水聚苯乙烯部分与橄榄苦苷分子中的非极性区域可产生疏水相互作用，形成“亲水-疏水”协同吸附的格局，进一步提高了吸附容量和选择性。

19、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

20、1、本发明所述的富氮树脂制备方法仅涉及氯甲基化树脂、聚乙烯亚胺和二卤代烃三种主要原料，通过常规的溶胀-反应-洗涤操作即可完成，无需复杂设备或苛刻反应条件。整个制备过程中不使用剧毒或高致癌性有机试剂（如氯甲醚等），操作安全性高，适合大规模工业化生产。经傅里叶变换红外光谱（ft-ir，图1）表征，可以清楚观察到胺基特征吸收峰的出现，证明聚乙烯亚胺的成功接枝；氮气吸/脱附曲线（图2）表明该树脂具有典型的介孔结构，比表面积和孔容均可满足高效吸附分离的需求。

21、2、本发明利用所制备的富氮树脂，仅通过“静态吸附-解吸附”的单步操作即可实现橄榄苦苷的高含量纯化，无需多级色谱联用（如大孔树脂+凝胶柱+ods柱或多步制备液相），避免了昂贵的色谱填料消耗和大量有机溶剂浪费。该工艺具有操作单元少、设备投资低、处理量大、溶剂可回收利用等优点，适合油橄榄叶这一大宗农业副产物资源的高值化利用。

22、4、本发明富氮树脂经解吸附后，可用水或低浓度有机溶剂洗涤再生，可重复使用至少5个循环而吸附性能无明显下降。再生操作简便、成本低廉，进一步降低了分离纯化橄榄苦苷的工业化生产成本。

23、5、本发明富氮树脂除用于橄榄苦苷的分离纯化外，基于其高密度胺基和三维交联网络结构，还可拓展应用于其他富含酚羟基天然产物（如茶多酚、花青素、黄酮类等）的分离富集，以及废水处理中酚类污染物的吸附去除等领域，具有良好的通用性和推广应用价值。