一种轮生炭角菌吉马烯A合酶突变体及其应用

本发明属于酶工程，尤其涉及一种轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体及其应用。

背景技术：

1、吉马烯a（germacrene a，ga）是多种倍半萜内酯及药用天然产物（如青蒿素、β-榄香烯等）的生物合成前体。ga的热重排产物β-榄香烯（β-elemene）具有广谱抗肿瘤、低毒性及良好的血脑屏障穿透能力，在肺癌、肝癌、脑胶质瘤等疾病治疗中展现出良好的应用前景。然而，目前β-榄香烯主要依赖从温郁金（curcuma wenyujin）等植物中提取，受制于植物生长周期长、提取工艺复杂及产物成分混杂等问题，生产成本高昂，严重制约其推广应用。

2、吉马烯a合酶（germacrene a synthase，gas）是催化法尼基焦磷酸（fpp）生成ga的关键酶。通过酶工程改造提高gas的催化效率，是实现ga及β-榄香烯高效微生物合成的核心策略之一。然而，传统酶改造主要依赖随机诱变与实验筛选，不仅工作量大、周期长，而且难以从分子层面解析酶活性变化机制。近年来，随着计算生物学和分子模拟技术的快速发展，基于蛋白结构预测、分子对接、虚拟突变及序列保守性分析的计算机辅助设计策略，能够在结构层面系统分析蛋白构象、底物结合模式及关键残基相互作用，从而显著提高突变位点筛选效率，为萜类合酶的半理性改造提供了重要技术支撑。

3、萜类合酶（tpss）是一类能够催化异戊二烯焦磷酸底物发生复杂环化与重排反应的关键酶，其催化过程涉及碳正离子中间体稳定、底物折叠构象调控以及活性口袋空间限制等多个分子事件。对于倍半萜合酶而言，活性中心内微小的结构变化即可显著影响底物折叠方式、碳正离子迁移路径及最终产物形成。因此，准确识别影响催化活性的关键残基是酶工程改造的重要前提。来源于轮生炭角菌（daldinia loculata）的dlgas是目前已知催化效率最高的ga合酶之一，但其催化效率仍有提升空间，且现有技术中尚无通过定点突变获得dlgas高活性突变体的报道。因此，开发一种催化活性显著提高的dlgas突变体，对于倍半萜类天然产物的高效生物合成具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对现有轮生炭角菌吉马烯a合酶催化效率不足、缺乏高活性突变体的技术问题，提出了一种轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体及其应用。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体，所述突变体是在野生型轮生炭角菌吉马烯a合酶的氨基酸序列基础上，将第119位甲硫氨酸突变为天冬酰胺，即m119n突变体。所述野生型dlgas的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述m119n突变体的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、另一方面，本发明提供了编码m119n突变体的核酸分子，其核苷酸序列如seq idno:3所示。

4、另一方面，本发明提供了包含上述核酸分子的重组表达载体，所述重组表达载体为pesc-leu；所述重组表达载体pesc-leu的制备方法包括以下步骤：

5、s1、根据目的基因的核苷酸序列设计特异性引物，在引物5′端引入与线性化pesc-leu载体末端同源的序列，以含有目的基因的质粒为模板进行pcr扩增；

6、s2、将线性化pesc-leu载体与pcr扩增的目的基因片段按摩尔比1:2的比例混合，加入5×裂解与延伸buffer和外切酶，于37℃孵育30min进行重组连接；

7、s3、将重组连接产物转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的lb平板，37℃倒置培养12-16h；

8、s4、挑取单菌落进行菌落pcr验证，阳性克隆提取质粒dna进行测序验证，确认目的基因序列及插入方向正确，即获得重组表达载体。

9、优选的，线性化pesc-leu载体的制备包括：使用限制性内切酶funicut bamh i和funicut sma i对pesc-leu载体进行双酶切处理。

10、另一方面，本发明提供了包含上述重组表达载体的重组宿主细胞，所述宿主细胞为工程酿酒酵母gq01。

11、另一方面，本发明提供了编码m119n突变体在制备吉马烯a中的应用。

12、另一方面，本发明提供了一种生产吉马烯a的方法，包括：构建表达m119n突变体的重组酿酒酵母，发酵培养，收集发酵产物，提取吉马烯a。

13、优选地，所述发酵培养中，发酵温度为28-30℃，振荡速率为200-220rpm，发酵时间为72-96h。

14、优选地，所述发酵培养还包括在发酵过程中添加d-半乳糖进行诱导，所述d-半乳糖的添加浓度为0.25-5mm。

15、优选地，所述d-半乳糖的添加浓度为1mm。

16、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

17、（1）本发明通过计算机辅助设计与半理性改造策略，以来源于轮生炭角菌的吉马烯a合酶（dlgas）为改造对象，首先利用同源建模构建dlgas三维结构模型，通过分子对接识别活性口袋关键残基，进一步结合丙氨酸扫描与虚拟饱和突变筛选获得m119n突变体，即将野生型dlgas第119位甲硫氨酸（met，m）突变为天冬酰胺（asn，n）；实验结果表明，m119n突变体在工程酿酒酵母gq01中表达的ga产量达到744mg/l，为野生型（393mg/l）的1.89倍，催化活性显著提高。

18、（2）分子对接分析表明，m119n突变通过优化活性口袋疏水核心与氢键网络，增强底物fpp的结合稳定性，从分子层面揭示了催化效率提升的机制。

19、（3）本发明通过半理性设计结合实验验证，建立了从计算机辅助筛选到突变体验证的完整酶工程改造体系，为萜类合酶的分子改造提供了可推广的技术方案。

20、（4）本发明获得的高活性dlgas突变体可用于构建高效工程菌，实现吉马烯a及其下游倍半萜天然产物的规模化生物合成，可广泛应用于医药、天然香料、功能化学品及合成生物学等领域，具有良好的工业应用前景。

1.一种轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体，其特征在于：所述突变体是在野生型轮生炭角菌吉马烯a合酶的氨基酸序列基础上，将第119位甲硫氨酸突变为天冬酰胺；

2.如权利要求1所述的一种轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体在制备吉马烯a中的应用。

3.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1所述的轮生炭角菌吉马烯a合酶突变体，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含权利要求3所述的核酸分子，所述重组表达载体通过将所述核酸分子克隆至pesc-leu载体中获得。

5.根据权利要求4所述的一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的宿主细胞为工程酿酒酵母gq01。

6.如权利要求4或5所述的重组表达载体在制备吉马烯a中的应用。

7.一种生产吉马烯a的方法，其特征在于，包括：构建表达权利要求1所述突变体的重组酿酒酵母，发酵培养，收集发酵产物，提取吉马烯a。

8.根据权利要求7所述的一种生产吉马烯a的方法，其特征在于：所述发酵培养的发酵温度为28-30℃，振荡速率为200-220rpm，发酵时间为72-96h。

9.根据权利要求7所述的一种生产吉马烯a的方法，其特征在于：还包括在发酵过程中添加d-半乳糖进行诱导，所述d-半乳糖的添加浓度为0.25-5mm。

10.根据权利要求9所述的一种生产吉马烯a的方法，其特征在于：所述d-半乳糖的添加浓度为1mm。