抗ACVR1抗体及其用途的制作方法

抗acvr1抗体及其用途
1.相关申请的交叉参考
2.本技术于2021年2月10日作为pct国际专利申请提交，并在35u.s.c.
§
119(e)下要求2020年2月11日提交的美国临时专利申请号62/975047和2020年5月26日提交的美国临时专利申请号63/030131的权益，其全部内容在此引入作为参考。
技术领域
3.本发明涉及特异性结合激活蛋白a受体1型(acvr1)和/或acvr1突变体蛋白的抗体和抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗和诊断方法。


背景技术：

4.激活蛋白a受体1型(acvr1；也称为actr1；或激活蛋白受体样激酶2；alk2)是一种单跨膜受体，是tgf-β受体超家族i型骨形态发生蛋白(bmp)受体的成员。配体结合后，acvr1与ii型受体一起启动下游信号传导级联，导致受体特异性r-smad蛋白(smad1、smad5或smad8)活化，然后其与smad4结合，导致基因的转录调节(massague 1998,massaque等2005)。
5.编码bmp i型受体alk2(也称为acvr1蛋白)的acvr1基因中的突变可以导致进行性骨化纤维增生症(fop)，这是一种罕见障碍，可导致软组织中进行性异位骨形成，并由于骨外骨桥导致身体运动严重受损。造成fop的acvr1突变导致smad依赖性下游信号传导的失调，并赋予突变的受体响应非标准配体(激活蛋白a)的反应能力，触发异位骨形成。编码acvr1的基因中的功能获得性突变导致人类中骨骼外(异位)骨化的衰弱性病症如fop。例如，典型的fop患者可以在acvr1蛋白的206位具有氨基酸精氨酸取代氨基酸组氨酸。这导致蛋白质的甘氨酸-丝氨酸激活域发生变化，将acvr1:激活蛋白a:acvr2非信号传导复合物转化为信号传导复合物。该激活蛋白新功能的结果是纤维-脂肪形成祖细胞(fap)启动软骨内骨化。涉及其他残基的非典型突变也可以类似起作用，导致acvr1蛋白在没有bmp存在的情况下仍停留在其活性构象中。acvr1基因中的突变也可以与弥漫性内生型桥脑胶质瘤(dipg)相关。
6.关键铁调节剂铁调素(hepcidin)的肝脏表达由骨形态发生蛋白(bmp)/smad途径控制。bmp信号传导需要配体(例如bmp7、bmp6或bmp2)、i型(例如acvr1)、ii型受体(例如acvr2或bmpr2)和共同受体铁调素调节蛋白(hemojuvelin，hjv)来磷酸化smad蛋白。bmp6介导的acvr1激活直接激活编码铁调素的基因hamp的转录。铁调素因导致膜铁转运蛋白(ferroportin，slc40a1)的内化而是铁水平的负调节因子，膜铁转运蛋白是唯一已知的铁输出蛋白。bmp6-acvr1信号传导级联的抑制导致hamp转录减少，导致循环铁调素水平降低。循环铁调素的减少导致膜铁转运蛋白水平提高，从而允许小肠对铁的吸收增加，从而增加循环铁水平。
7.抗acvr1的单克隆抗体描述于katagiri等的美国专利/公开号10428148、20180118835以及wo 2019172165中。
8.以高亲和力特异性结合acvr1蛋白、其片段或其突变体并抑制acvr1介导的骨形态发生蛋白(bmp)信号转导的全人抗体，在预防和治疗例如异位骨化、异常骨化、骨发育不良、贫血或弥漫性内生型桥脑胶质瘤中可能是重要的。
9.发明概述
10.本发明提供特异性结合激活蛋白a受体1型(acvr1)蛋白并抑制acvr1介导的bmp信号转导的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，该抗acvr1抗体是以高亲和力结合acvr1并阻断acvr1或使活化构象去稳定化的全人抗体。本发明的抗体尤其可用于失活或降低acvr1蛋白的活性。在某些实施方案中，该抗体可用于在个体中预防、治疗或改善acvr1相关疾病或病症的至少一种症状或指征。在某些实施方案中，该抗体可以预防性或治疗性地对患有或有风险患有acvr1相关疾病或病症的个体施用。在具体实施方案中，该抗体用于在有需要的个体中预防和治疗异常骨化(heterotopic ossification)、异位骨化(ectopic ossification)、骨发育不良(bone dysplasia)、贫血或某些癌症，包括脑瘤。
11.在一些实施方案中，本发明的抗体结合acvr1蛋白和/或其突变体。此外，本文公开的抗体以高亲和力结合acvr1蛋白或其突变体。本发明中使用的acvr1蛋白包括可源自哺乳动物如人或小鼠的acvr1蛋白质。例如，人acvr1的全长氨基酸序列可通过uniprotkb登录号q04771(seq id no:341)获得。
12.acvr1蛋白可包括存在于例如登录号q04771(seq id no:341)的acvr1蛋白的位置1-20的信号肽。成熟acvr1蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的氨基酸21-509。acvr1蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的氨基酸21-123的胞外结构域。acvr1蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的氨基酸124-146的跨膜结构域。acvr1蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的位置208-502中的蛋白激酶结构域。acvr蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的包含n-连接(glcnac
…
)天冬酰胺的氨基酸位置102处的糖基化。acvr蛋白可以包括例如登录号q04771(seq id no:341)的位置501处的修饰残基，例如磷酸丝氨酸。
13.acvr1基因中的突变可以负责包括fop在内的多种疾病。acvr1蛋白可以是具有可见于多种家族性和散发性fop病例中的氨基酸取代的突变体acvr1蛋白。人acvr1蛋白可以包含多种突变，包括但不限于seq id no:341的l196p(脯氨酸取代196位的亮氨酸的突变)、delp197_f198insl(缺失197位的脯氨酸和198位的苯丙氨酸并插入亮氨酸的突变)、r202i(异亮氨酸取代202位的精氨酸的突变)、r206h(组氨酸取代206位的精氨酸的突变)、q207e(谷氨酸取代207位的谷氨酰胺的突变)、r258s(丝氨酸取代258位的精氨酸的突变)、r258g(甘氨酸取代258位的精氨酸的突变)、g325a(丙氨酸取代325位的甘氨酸的突变)、g328e(谷氨酸取代328位的甘氨酸的突变)、g328r(精氨酸取代328位的甘氨酸的突变)、g328w(色氨酸取代328位的甘氨酸的突变)、g356d(天冬氨酸取代356位的甘氨酸的突变)和r375p(脯氨酸取代375位的精氨酸的突变)。
14.作为另一实例，小鼠acvr1蛋白的全长氨基酸序列可参考登录号p37172(seq id no:342)获得。
15.本发明的抗体可以是全长抗体(例如igg1或igg4抗体)，或者可以仅包含抗原结合部分(例如fab、f(ab’)2或scfv片段)，并且可以经修饰以影响功能性，例如增加在宿主中的持久性或消除残余效应子功能(reddy等,2000,j.immunol.164:1925-1933)。在某些实施方
案中，该抗体可以是双特异性抗体。
16.在第一方面，本发明提供特异性结合acvr1蛋白的分离的重组单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗体是全人单克隆抗体。
17.本发明的示例性抗acvr1抗体在本文表1和表2中列出。表1列出了示例性抗体的重链可变区(hcvr)、轻链可变区(lcvr)、重链互补决定区(hcdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和轻链互补决定区(lcdr)(lcdr1、lcdr2和lcdr3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗体的hcvr、lcvr、hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的核酸序列标识符。
18.本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含hcvr，所述hcvr包含选自表1中所列的任何hcvr氨基酸序列的氨基酸序列、或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
19.本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含lcvr，所述lcvr包含选自表1中所列的任何lcvr氨基酸序列的氨基酸序列、或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
20.本发明还提供包含hcvr和lcvr氨基酸序列对(hcvr/lcvr)的抗体或其抗原结合片段，所述hcvr/lcvr氨基酸序列对包含表1中所列的任何hcvr氨基酸序列以及与之配对的表1中所列的任何lcvr氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其含有包含在表1中所列的任何示例性抗acvr1抗体内的hcvr/lcvr氨基酸序列对。在某些实施方案中，本发明的抗acvr1抗体包含选自seq id nos:2/10(例如mab27396)、22/30(例如mab27241)、22/72(例如mab27245)、42/48(例如mab27242)、58/62(例如mab27243)、76/84(例如mab27247)、96/104(例如mab27404)、116/119(例如mab27405)、128/136(例如mab27400)、203/211(例如mab29226),273/277(例如mab29257)和300/307(例如mab29266)之一的hcvr/lcvr氨基酸序列对。
21.本发明还提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该hcvr包含具有不超过12个氨基酸取代的表1中所列的氨基酸序列，和/或该lcvr包含具有不超过10个氨基酸取代的表1中所列的氨基酸序列。例如，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该hcvr包含表1中所列的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个氨基酸取代。在另一个实例中，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该lcvr包含表1中所列的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸取代。在一个实施方案中，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗acvr1抗体或其抗原结合片段，该hcvr包含表1中所列的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代，和/或该lcvr包含表1中所列的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有至少一个氨基酸取代。
22.本发明还提供包含重链cdr1(hcdr1)的抗体或其抗原结合片段，该重链cdr1包含选自表1中所列的任何hcdr1氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
23.本发明还提供包含重链cdr2(hcdr2)的抗体或其抗原结合片段，该重链cdr2包含选自表1中所列的任何hcdr2氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
24.本发明还提供包含重链cdr3(hcdr3)的抗体或其抗原结合片段，该重链cdr3包含
选自表1中所列的任何hcdr3氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
25.本发明还提供包含轻链cdr1(lcdr1)的抗体或其抗原结合片段，该轻链cdr1包含选自表1中所列的任何lcdr1氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
26.本发明还提供包含轻链cdr2(lcdr2)的抗体或其抗原结合片段，该轻链cdr2包含选自表1中所列的任何lcdr2氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
27.本发明还提供包含轻链cdr3(lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，该轻链cdr3包含选自表1中所列的任何lcdr3氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似序列。
28.本发明还提供包含hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，该氨基酸序列对包含表1中所列的任何hcdr3氨基酸序列以及与之配对的表1中所列的任何lcdr3氨基酸序列。根据某些实施方案，本发明提供包含hcdr3/lcdr3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段，该氨基酸序列对包含在表1中所列的任何示例性抗acvr1抗体内。在某些实施方案中，该hcdr3/lcdr3氨基酸序列对选自seq id nos:28/36(例如mab27242)、60/66(例如mab27243)、82/90(例如mab27247)、8/16(例如mab27396)、102/110(例如mab27405),28/66(例如mab27245),134/142(例如mab27400),209/217(例如mab29226),261/283(例如mab29257)和305/313(e.g.,mab29266)。
29.本发明还提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该hcvr包含：含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr1，含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr2，以及含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr3。在某些实施方案中，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该lcvr包含：含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr1，含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr2，以及含有与表1中所列的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr3。例如，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该hcvr包含：含有seq id no:24或44的氨基酸序列或与seq id no:24或44相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr1，含有seq id no:46的氨基酸序列或与seq id no:46相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr2，以及含有seq id no:28或60的氨基酸序列或与seq id no:28或60相差1个氨基酸的氨基酸序列的hcdr3。在另一个示例性实施方案中，本发明提供包含hcvr和lcvr的抗体或其抗原结合片段，该lcvr包含：含有seq id no:50的氨基酸序列或与seq id no:50相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr1，含有seq id no:52或64的氨基酸序列或与seq id no:52或64相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr2，以及含有seq id no:36或66的氨基酸序列或与seq id no:36或66相差1个氨基酸的氨基酸序列的lcdr3。
30.本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其含有包含在表1中所列的任何示例性抗体中的一组六个cdr(即hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。在某些实施方案中，该hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组选自seq id nos:44-46-28-50-52-36(例如mab27242)、24-46-60-50-64-66(例如mab27243)、78-80-82-86-88-90(例如
mab27247)、4-6-8-12-14-16(例如mab27396)、98-100-102-106-122-110(例如mab27405)、98-100-102-106-108-110(例如mab27404)、24-26-28-50-64-66(例如mab27245)、24-26-28-32-34-36(例如mab27241)、130-132-134-138-140-142(例如mab27400)、205-207-209-213-215-217(例如mab29226)、257-275-261-279-281-283(例如mab29257)和4-303-305-309-311-313(例如mab29266)。
31.在相关实施方案中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其含有包含在表1所列的任何示例性抗体所定义的hcvr/lcvr氨基酸序列对中的一组六个cdr(即hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。例如，本发明包括抗体或其抗体结合片段，其含有包含在选自以下的hcvr/lcvr氨基酸序列对内的hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组：seq id nos:2/10(例如mab27396)、22/30(例如mab27241)、22/72(例如mab27245)、42/48(例如mab27242)、58/62(例如mab27243)、76/84(例如mab27247)、96/104(例如mab27404)、116/119(例如mab27405)、128/136(例如mab27400)、203/211(例如mab29226)、273/277(例如mab29257)和300/307(例如mab29266)。
32.用于鉴定hcvr和lcvr氨基酸序列内的cdr的方法和技术为本领域公知，并且可用于鉴定本文公开的具体hcvr和/或lcvr氨基酸序列内的cdr。可用于鉴定cdr边界的示例性规则包括例如kabat定义、chothia定义和abm定义。一般而言，kabat定义基于序列可变性，chothia定义基于结构环区域的位置，而abm定义是kabat和chothia方法之间的折衷。参见例如kabat,"sequences of proteins of immunological interest,"national institutes of health,bethesda,md.(1991)；al-lazikani等,j.mol.biol.273:927-948(1997)；以及martin等,proc.natl.acad.sci.usa 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的cdr序列。
33.在某些实施方案中，本发明包括特异性结合acvr1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段含有包含在重链可变区(hcvr)内的三个重链互补决定区(cdr)(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和包含在轻链可变区(lcvr)中的三个轻链cdr(lcdr1、lcdr2和lcdr3)，其中该hcvr包含：(i)选自seq id no:2、22、42、58、76、96、116、128、148、166、186、203、223、241、255、273、289、300和319的氨基酸序列；(ii)与选自seq id no:2、22、42、58、76、96、116、128、148、166、186、203、223、241、255、273、289、300和319的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；(iii)与选自seq id no:2、22、42、58、76、96、116、128、148、166、186、203、223、241、255、273、289、300和319的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(iv)选自seq id no:2、22、42、58、76、96、116、128、148、166、186、203、223、241、255、273、289、300和319的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有不超过12个氨基酸取代；并且该lcvr包含：(a)选自seq id no:10、30、48、62、72、84、104、119、136、156、174、193、211、231、245、263、277、293、307和327的氨基酸序列；(b)与选自seq id no:10、30、48、62、72、84、104、119、136、156、174、193、211、231、245、263、277、293、307和327的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；(c)与选自seq id no:10、30、48、62、72、84、104、119、136、156、174、193、211、231、245、263、277、293、307和327的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；或(d)选自seq id no:10、30、48、62、72、84、104、119、136、156、174、193、211、231、245、263、277、293、307和327的氨基酸序列，且该氨基酸序列具有不超过10个氨基酸取代。
34.在某些优选实施方案中，本发明包括以拮抗剂方式特异性结合acvr1，即减少或阻断acvr1结合和/或活性的抗体。
35.本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗acvr1抗体。在一些实施方案中，可以通过去除不希望的糖基化位点的修饰、或通过缺乏存在于寡糖链上的岩藻糖部分的抗体，来例如提高抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能(参见shield等(2002)jbc 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(cdc)。
36.在某些实施方案中，本发明提供表现出ph依赖性的acvr1结合的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括在中性ph下比在酸性ph下以更高的亲和力结合acvr1(即在酸性ph下结合减少)的抗体和其抗原结合片段。
37.本发明还提供与包含hcvr的cdr和lcvr的cdr的抗体或其抗原结合片段竞争特异性结合acvr1的抗体及其抗原结合片段，其中该hcvr和lcvr各自具有选自表1中所列的hcvr序列和lcvr序列的氨基酸序列。
38.本发明还提供与参考抗体或其抗原结合片段交叉竞争结合acvr1的抗体及其抗原结合片段，该参考抗体或抗原结合片段包含hcvr的cdr和lcvr的cdr，其中该hcvr和lcvr各自具有选自表1中所列的hcvr序列和lcvr序列的氨基酸序列。
39.本发明还提供与参考抗体或其抗原结合片段结合相同表位的抗体及其抗原结合片段，该参考抗体或抗原结合片段包含hcvr的三个cdr和lcvr的三个cdr，其中该hcvr和lcvr各自具有选自表1中所列hcvr和lc vr序列的氨基酸序列。
40.本发明还提供分离的抗体及其抗原结合片段，其抑制由bmp7、激活蛋白a或与激活蛋白ii型受体形成信号传导复合物的其他tgfβ家族配体介导的、配体诱导的信号传导。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段阻止acvr1与激活蛋白ii型受体形成信号传导复合物。本发明提供分离的抗体及其抗原结合片段，其可以与bmp7或激活蛋白a或激活蛋白ii型受体结合acvr1上的相同表位，或者可以与bmp7或激活蛋白a或激活蛋白ii型受体结合acvr1上的不同表位。
41.在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段是双特异性的，包含对acvr1的第一表位的第一结合特异性和对acvr1的第二表位的第二结合特异性，其中该第一和第二表位不同且不重叠。
42.在某些实施方案中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其具有以下一个或多个特征：
43.(a)是全人单克隆抗体；
44.(b)在表面等离子体共振测定中测量，在25℃以小于60nm、小于12nm、小于2nm、小于1nm或小于0.5nm的解离常数(kd)，结合与fc融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:339)；
45.(c)在表面等离子体共振测定中测量，在37℃以小于150nm、小于15nm、小于5nm、小于1.5nm或小于1nm的解离常数(kd)，结合与mfc融合的人acvr1胞外结构域(seq id no:339)；
46.(d)在表面等离子体共振测定中测量，在25℃以小于300nm、小于150nm、小于25nm、小于10nm、小于5nm、小于3nm或小于2nm的kd，结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:338)；
47.(e)在表面等离子体共振测定中测量，在37℃以小于500nm、小于50nm、小于25nm、小于10nm的kd，结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:338)；
48.(f)不结合小鼠acvr1，或在表面等离子体共振测定中测量，在25℃以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如seq id no:340)；
49.(g)不结合小鼠acvr1，或在表面等离子体共振测定中测量，在37℃以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如seq id no:340)；
50.(k)结合表达人acvr1蛋白或人acvr(r206h)蛋白的细胞；
51.(l)在基于细胞的生物测定中测量，以小于25nm的ic
50
抑制人激活蛋白a对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活；
52.(m)在基于细胞的生物测定中测量，以小于20nm、小于5nm、小于3nm或小于1nm或更小的ic
50
抑制人bmp7对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活；
53.(m)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时，显著减少血清铁调素；
54.(n)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时，显著提高血清铁水平；和/或
55.(o)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时，抑制野生型acvr1信号传导；和
56.(p)包含含有选自表1中所列的hcvr序列的氨基酸序列的hcvr和含有选自表1中所列的lcvr序列的氨基酸序列的lcvr。
57.在第二方面，本发明提供编码抗acvr1抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供编码表1中所列的任何hcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列，或其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
58.本发明还提供编码表1中所列的任何lcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
59.本发明还提供编码表1中所列的任何hcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何hcdr1核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
60.本发明还提供编码表1中所列的任何hcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何hcdr2核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
61.本发明还提供编码表1中所列的任何hcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何hcdr3核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
62.本发明还提供编码表1中所列的任何lcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何lcdr1核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
63.本发明还提供编码表1中所列的任何lcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方
案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何lcdr2核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
64.本发明还提供编码表1中所列的任何lcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何lcdr3核酸序列的多核苷酸序列，或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。
65.本发明还提供编码hcvr的核酸分子，其中该hcvr包含一组三个cdr(即hcdr1-hcdr2-hcdr3)，其中该hcdr1-hcdr2-hcdr3氨基酸序列组如表1中所列的任何示例性抗体所定义。
66.本发明还提供编码lcvr的核酸分子，其中该lcvr包括一组三个cdr(即lcdr1-lcdr2-lcdr3)，其中该lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组如表1中所列的任何示例性抗体所定义。
67.本发明还提供编码hcvr和lcvr二者的核酸分子，其中该hcvr包含表1中所列的任何hcvr氨基酸序列，并且其中该lcvr包含表1中所列的任何lcvr氨基酸序列。在某些实施方案中，该核酸分子包含选自表2中所列的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列、或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列，以及选自表1中所列的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列、或与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列。在根据本发明的这方面的某些实施方案中，该核酸分子编码hcvr和lcvr，其中该hcvr和lcvr源自表1中所列的相同抗acvr1抗体。
68.在一个相关方面，本发明提供能够表达包含抗体的重链可变区和/或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本发明包括包含上述任何核酸分子(即编码如表2中所示的任何hcvr、lcvr和/或cdr序列的核酸分子)的重组表达载体。在某些实施方案中，本发明提供包含以下的表达载体：(a)含有编码结合acvr1的抗体的hcvr的核酸序列的核酸分子，其中该hcvr包含选自表1中所列序列的氨基酸序列；和/或(b)含有编码结合acvr1的抗体的lcvr的核酸序列的核酸分子，其中该lcvr包含选自表1中所列序列的氨基酸序列。本发明范围内还包括：已将此类载体引入其中的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养该宿主细胞并回收如此产生的抗体和抗体片段来产生该抗体或其部分的方法。在某些实施方案中，该宿主细胞包括哺乳动物细胞或原核细胞。在某些实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞或大肠杆菌(e.coli)细胞。在某些实施方案中，本发明提供产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括将表达载体引入宿主细胞，该表达载体包含与启动子有效连接的编码本发明的抗体或其抗原结合片段的hcvr和/或lcvr的核酸序列；在有利于表达该核酸序列的条件下培养宿主细胞；以及从培养基和/或宿主细胞分离抗体或其抗原结合片段。可使用现有技术中已知的任何方法纯化该分离的抗体或其抗原结合片段。
69.在第三方面，本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种特异性结合acvr1的重组单克隆抗体或其抗原结合片段和可药用载体。在一个相关方面，本发明的特征在于这样的组合物，该组合物是抗acvr1抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，该第二治疗剂是可以有利地与抗acvr1抗体联合的任何活性剂。
70.可有利地与抗acvr1抗体联合的示例性活性剂包括但不限于，结合和/或激活acvr1活性的其他活性剂(包括其他抗体或其抗原结合片段等)和/或不直接结合acvr1但仍
治疗或改善acvr1相关疾病或病症的至少一种症状或指征的活性剂(在本文中其他地方公开)。涉及本发明抗acvr1抗体的其他联合治疗和共制剂在本文中其他地方公开。
71.在第四方面，本发明提供用本发明的抗acvr1抗体或抗体的抗原结合部分在个体中治疗与acvr1相关的疾病或病症的治疗方法，其中该治疗方法包括对有需要的个体施用治疗有效量的包含本发明抗体或抗原结合片段的药物组合物。所治疗的病症是通过增强acvr1活性可以被改善、缓解、抑制或防止的任何疾病或病症(例如贫血、异位骨化、异常骨化、骨发育不良或弥漫性内生型桥脑胶质瘤)。在某些实施方案中，本发明提供预防或治疗acvr1相关疾病或病症的方法，其包括对有需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗acvr1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段可预防性或治疗性地对患有或有风险患有acvr1相关疾病或病症的个体施用。在某些实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合对有需要的个体施用。
72.该第二治疗剂可选自：抗激活蛋白a抗体或其抗原结合片段、抗bmp7抗体或其抗原性结合片段、抗acvr2抗体或其抗原结合片段、抗炎药、类固醇、二膦酸盐、肌肉松弛剂或视黄酸受体(rar)γ激动剂、生活方式改变剂、膳食补充剂和本领域已知的任何其他药物或治疗。在某些实施方案中，该第二治疗剂可以是有助于对抗或减少与本发明的抗体或其抗原结合片段相关的任何可能的副作用(如果发生这种副作用)的活性剂。该抗体或其片段可以皮下、静脉内、皮内、腹腔内、口服、肌内或脑室内施用。该抗体或其片段可以按约0.1mg/kg个体体重至约100mg/kg个体体重的剂量施用。在某些实施方案中，本发明的抗体可以按包含10mg至600mg的一个或多个剂量施用。
73.本发明还包括本发明的抗acvr1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗将从acvr1结合和/或活性的激活受益的疾病或病症的药物中的用途。
74.其他实施方案将从以下详细描述中是显而易见的。
75.附图简述
76.图1a显示，在wt小鼠体内创伤后ho模型中，手术后13周期间通过microct测量的总异位骨化(ho)体积图。与诱导损伤同时开始，对小鼠施用同种型对照抗体(圆圈，n＝12)或alk3 fc(正方形，n＝12)或acvr1抗体mab27242(三角形，n＝12)。损伤后3、6、9和13周，通过μct测量ho体积。到手术后9周，与同种型对照相比，acvr1阻断性抗体显著减弱总ho(p《0.05)。
77.图1b显示，在wt小鼠体内创伤后ho模型中，手术后13周期间通过microct测量的附着性异位骨化(attached ho)体积图。与诱导损伤同时开始，对小鼠施用同种型对照抗体(圆圈，n＝12)、alk3 fc(正方形，n＝12)或acvr1抗体mab27242(三角形，n＝12)。损伤后3、6、9和13周，通过μct测量ho体积。到手术后9周，与同种型对照相比，acvr1阻断性抗体显著减弱附着性ho(p《0.05)。
78.图1c显示，在wt小鼠体内创伤后ho模型中，手术后13周期间通过microct测量的非附着异位骨化(unattached ho)体积图。与诱导损伤同时开始，对小鼠施用同种型对照抗体(圆圈，n＝12)、alk3 fc(正方形，n＝12)或acvr1抗体mab27242(三角形，n＝12)。损伤后3、6、9和13周，通过μct测量ho体积。到手术后13周，与同种型对照相比，acvr1阻断性抗体显著减弱附着ho(p《0.01)。
79.图2a-c显示，wt小鼠体内创伤后ho模型中，在损伤的后肢中的ho体积图像，由手术
后13周通过microct测量的总ho体积、附着ho(白色断线圈)或非附着ho(白色短虚线圈)量度。
80.图2a显示，wt小鼠体内创伤后ho模型中，损伤后肢中的ho体积的代表性图像，其中在接受同种型对照抗体后，手术后13周通过microct测量总ho体积、附着ho(白色断线圈)或非附着ho(白色断线圈)。
81.图2b显示，wt小鼠体内创伤后ho模型中，损伤后肢中的ho体积的代表性图像，其中在接受alk3-fc后，手术后13周通过microct测量总ho体积、附着ho(白色断线圈)或非附着ho(白色断线圈)。与接受同种型对照的小鼠相比，接受alk3-fc的小鼠在13周后通过microct测量的ho体积显著降低。
82.图2c显示，wt小鼠体内创伤后ho模型中，损伤后肢中的ho体积的代表性图像，其中在接受抗acvr抗体mab27242后，手术后13周通过microct测量总ho体积、附着ho(白色断线圈)或非附着ho(白色断线圈)。与接受同种型对照抗体的小鼠相比，接受抗acvr抗体的小鼠在13周后通过microct测量的ho体积显著降低。
83.发明详述
84.在描述本方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
85.除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文中所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利和专利申请在此以其整体引入作为参考。
86.定义
87.术语“acvr1”，也称为“alk2”，是指激活蛋白a受体1型(也称为激活蛋白样激酶2)。acvr1是一种单跨膜i型膜蛋白。人acvr1的全长氨基酸序列可参考uniprotkb登录号q04771获得，其具有509个氨基酸残基(seq id no:341)。该蛋白具有氨基酸残基21-123处的胞外结构域、氨基酸位置124-146处的跨膜结构域以及位置147-509处的胞质结构域。在配体结合时，acvr1形成由两个ii型和两个i型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶组成的受体复合物。ii型受体磷酸化并激活i型受体。其自磷酸化，然后结合并激活smad转录调节因子。acvr1是激活蛋白的受体。
88.全长人acvr1蛋白的氨基酸序列通过uniprotkb/swiss prot中作为登录号q04771提供的氨基酸序列(seq id no:341)来举例说明。小鼠acvr1蛋白的全长氨基酸序列可参考登录号p37172(seq id no:342)获得。
89.术语“acvr1”包括重组acvr1蛋白或其片段。该术语还涵盖与例如组氨酸标签、padre标签、小鼠或人fc或信号序列(例如seq id no:338-340)偶联的acvr1蛋白或其片段。
90.术语“acvr1”可包括包含突变的acvr1蛋白或其片段。例如，突变可以基于人acvr1uniprotkb登录号q04771(seq id no:341)的相应氨基酸序列或其片段。例如，acvr1蛋白或其片段可包含突变，其包括但不限于相应seq id no:341的l196p、delp197_f198insl、r202i、r206h、q207e、r258s、r258g、g325a、g328e、g328r、g328w、g356d和r375p。
91.本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链(通过二硫键相互连接的两条重(h)链
和两条轻(l)链)组成的免疫球蛋白分子(即“全抗体分子”)、以及其多聚体(如igm)或其抗原结合片段。每条重链由重链可变区(“hcvr”或“v
h”)和重链恒定区(由结构域ch1、ch2和ch3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(“lcvr”或“v
l”)和轻链恒定区(c
l
)组成。vh和v
l
区域可进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区、和散布于其间的称为构架区(fr)的更保守区域。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本发明的某些实施方案中，抗体(或其抗原结合片段)的fr可以与人种系序列相同，或者可以经天然或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于两个或多个cdr的并排分析来定义。
92.一个或多个cdr残基的取代或一个或多个cdr的缺失也是可能的。在科学文献中描述了抗体，其中可以省去一个或两个cdr用于结合。padlan等(1995faseb j.9:133-139)基于公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，并得出结论，只有大约五分之一到三分之一的cdr残基实际接触抗原。padlan还发现了许多这样的抗体，其中一个或两个cdr没有与抗原接触的氨基酸(还见vajdos等2002j mol biol 320:415-428)。
93.不接触抗原的cdr残基可以基于先前的研究(例如cdrh2中的残基h60-h65通常不需要)、从位于chothia cdr之外的kabat cdr区域、通过分子建模和/或经验鉴定。如果省略cdr或其残基，则通常将其替代为在另一人抗体序列中占据相应位置的氨基酸或这些序列的共有氨基酸。cdr内的取代位置和待取代的氨基酸也可以根据经验选择。经验取代可以是保守取代或非保守取代。
94.与相应的种系序列相比，本文公开的全人抗acvr1单克隆抗体可在重链和轻链可变结构域的构架区和/或cdr区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这类突变。本发明包括衍生自本文公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个构架区和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变为衍生该抗体的种系序列的相应残基，或另一人种系序列的相应残基，或相应种系残基的保守氨基酸取代(这类序列改变在本文中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生包含一个或多个种系单突变或其组合的多种抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，将vh和/或v
l
结构域内的所有构架残基和/或cdr残基，回复突变为该抗体来源的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅将某些残基回复突变为原始种系序列，例如，仅见于fr1的最前8个氨基酸或fr4的最后8个氨基酸内的突变残基，或仅见于cdr1、cdr2或cdr3内的突变残基。在其他实施方案中，将构架残基和/或cdr残基中一个或多个突变为不同种系序列(即不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明的抗体可包含在构架区和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任意组合，例如，其中将某些单残基突变为特定种系序列的相应残基，而将与原始种系序列不同的某些其他残基保持或突变为不同种系序列的相应残基。包含一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段，一旦获得，可以容易地针对一种或多种所希望的特性进行测试，例如，改善的结合特异性、提高的结合亲和力、改善或增强的拮抗性生物学特性、降低的免疫原性等。以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明中。
95.本发明还包括这样的全人抗acvr1单克隆抗体，其包含本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的具有一个或多个保守取代的变体。例如，本发明包括具有这样的
hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列的抗acvr1抗体，其相对于本文公开的任何hcvr、lcvr和/或cdr氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
96.本文所用的术语“人抗体”或“全人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mab可以，例如在cdr尤其是cdr3中，包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用的术语“人抗体”或“全人抗体”并不旨在包括已将衍生自另一哺乳动物物种(例如小鼠)种系的cdr序列移植到人fr序列上得到的mab。该术语包括在非人哺乳动物或非人哺乳动物的细胞中重组产生的抗体。该术语并不旨在包括从人个体分离或在人个体中产生的抗体。
97.本文所用的术语“重组”是指通过本领域称为重组dna技术(包括例如dna剪接和转基因表达)的技术或方法创造、表达、分离或获得的本发明的抗体或其抗原结合片段。该术语指在非人哺乳动物(包括转基因非人哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如cho细胞)表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的抗体。
98.术语“特异性结合”或“与
…
特异性结合”等是指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过至少约1x10-8
m或更小的平衡解离常数来表征(例如，kd越小表示结合越紧密)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法为本领域公知，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所述，通过表面等离子体共振(例如biacore
tm
)鉴定了特异性结合acvr1的抗体。此外，如本文所使用，与acvr1中的一个结构域结合并与一个或多个其他抗原结合的多特异性抗体、或与acvr1的两个不同区域结合的双特异性抗体，也仍被认为是“特异性结合”的抗体。
99.术语“高亲和力”抗体是指，通过表面等离子体共振(例如biacore
tm
)或溶液亲和力elisa测量，对acvr1具有至少10-8
m、优选10-9
m、更优选10-10
m、甚至更优选10-11
mkd表示的结合亲和力的那些mab。
100.术语“慢解离速率”、“koff”或“kd”是指，通过表面等离子体共振(例如biacore
tm
)测定，以1x10-3
s-1
或更小、优选1x10-4
s-1
或更小的速率常数从acvr1解离的抗体。
101.本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在、可酶促获得、合成或遗传改造的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。本文使用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体的一个或多个片段，其保持与acvr1蛋白结合的能力。
102.在具体实施方案中，本发明的抗体或抗体片段可缀合诸如以下的部分：配体或治疗部分(“免疫缀合物”)、第二抗acvr1抗体或用于治疗acvr1相关疾病或病症的任何其他治疗部分。
103.本文所用的“分离的抗体”意指，基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(ab)的抗体(例如，特异性结合acvr1的分离的抗体或其片段，基本上不含特异性结合acvr1之外的抗原的ab)。
104.本文所用的“失活性抗体”或“拮抗性抗体”(或“降低或阻断acvr1活性的抗体”或“使活化构象失稳定的抗体”)意指，所述抗体与acvr1的结合将导致acvr1的至少一种生物学活性的失活。例如，本发明的抗体可在对有需要的个体施用时减少贫血。
105.本文所用的术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象，其允许通过例如使用biacore
tm
系统(pharmacia biosensor ab,uppsala,sweden and piscataway,n.j.)检测生物传感器基质中的蛋白质浓度变化来分析实时生物分子相互作用。
106.本文所用的术语“k
d”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
107.术语“表位”是指与抗体分子可变区中称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多个表位。因此，不同的抗体可结合抗原上的不同区域，并可具有不同的生物学效应。术语“表位”还指抗原上对b细胞和/或t细胞产生应答的位点。它也指抗体所结合的抗原区域。表位可以定义为结构表位或功能表位。功能表位通常是结构表位的子集，并具有直接对相互作用亲和力产生贡献的那些残基。表位也可以是构象表位，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可以包括这样的决定簇，其是分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基团或磺酰基团，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
108.本文所用的术语“交叉竞争”是指抗体或其抗原结合片段与抗原结合并抑制或阻断另一抗体或其抗原结合片段的结合。该术语还包括两种抗体在两个方向上的竞争，即第一抗体结合并阻断第二抗体的结合，反之亦然。在某些实施方案中，第一和第二抗体可以结合到相同的表位。备选地，第一和第二抗体可以结合不同但重叠的表位，从而例如通过空间位阻，一个抗体的结合抑制或阻断第二抗体的结合。抗体之间的交叉竞争可以通过本领域已知的方法测量，例如通过实时、无标记生物层干涉测定法。两种抗体之间的交叉竞争可表现为第二抗体的结合小于由于自身-自身结合(其中第一和第二抗体是相同的抗体)而导致的背景信号。2种抗体之间的交叉竞争可以表现为，例如，小于基线自身-自身背景结合(其中第一和第二抗体是相同的抗体)的第二抗体结合百分比。
109.在提及核酸或其片段时，术语“基本同一”或“基本相同”表示，在进行适当的核苷酸插入或缺失的情况下与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约90％且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，如通过任何熟知的序列同一性算法fasta、blast或gap测量的，见下文讨论。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子，将编码与参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本相似的氨基酸序列的多肽。
110.在应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本相似”是指，两个肽序列在(例如用默认缺口权重通过程序gap或bestfit)最佳比对时，具有至少90％序列同一性，甚至更优选至少95％、98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中一个氨基酸残基用另一个具有类似化学性质(如电荷或疏水性)的侧链(r基团)的氨基酸残基取代。一般而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可向上调整相似性的百分比或程度，以校正取代的保守性质。进行这种调整的手段为本领域技术人员公知，参见例如pearson(1994)methods mol.biol.24:307-331，其在此引入作为参考。具有类似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代
组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。备选地，保守取代是在gonnet等(1992)science 256:144345中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化，其在此引入作为参考。“中度保守”取代是在pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
111.通常使用序列分析软件测量多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其他修饰(包括保守氨基酸取代)的相似性量度来匹配相似序列。例如，gcg软件包含诸如gap和bestfit的程序，这些程序可以以默认参数使用，以确定紧密相关的多肽之间，如来自不同物种生物体的同源多肽之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间，的序列同源性或序列同一性。参见例如gcg版本6.1。多肽序列也可以使用fasta(gcg版本6.1中的一个程序)，以默认或推荐参数进行比较。fasta(例如fasta2和fasta3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(pearson(2000)上引文)。在将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一优选算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。参见例如altschul等(1990)j.mol.biol.215:403-410和(1997)nucleic acids res.25:3389-3402，其在此引入作为参考。
112.短语“治疗有效量”是指施用后产生所希望达到的效果的量。精确量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如lloyd(1999)the art,science and technology of pharmaceutical compounding)。
113.本文所用的术语“个体”是指需要改善、预防和/或治疗acvr1相关疾病或病症(如贫血或异位骨化)的动物，优选哺乳动物，更优选人。该术语包括患有这种疾病或病症或处于患上这种疾病或病症的风险中的人个体。
114.本文所用的术语“治疗”是指，通过对有需要的个体施用治疗剂如本发明的抗体，降低或改善acvr1相关疾病或病症的至少一种症状或指征的严重性。该术语包括抑制疾病进展或症状/指征恶化。该术语还包括疾病的积极预后，即在施用治疗剂如本发明的抗体后，个体可以无疾病或可以疾病减轻。治疗剂可以按治疗剂量对个体施用。
115.术语“预防”是指，在施用本发明的抗体后，抑制acvr1相关疾病或病症或这种疾病或病症的任何症状或指征的表现。
116.抗体的抗原结合片段
117.除非另有明确说明，本文所用的术语“抗体”应理解为涵盖包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“全抗体分子”)及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括，可以特异性结合抗原以形成复合物的、任何天然存在、可酶促获得、合成或遗传改造的多肽或糖蛋白。本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合acvr1蛋白、其片段和/或其突变体的能力。抗体片段可包括fab片段、f(ab')2片段、fv片段、dab片段、包含cdr的片段或分离的cdr。在某些实施方案中，术语“抗原结合片段”是指多特异性抗原结合分子的多肽片段。抗体的抗原结合片段可以使用任何合适的标准技术，例如蛋白水解消化，从例如全抗体分子衍生，或使用涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和(可选地)恒定结构域的dna的重组基因工程技术来产生。这种dna是已知的和/或可从例如商业来源、dna文库(包括例如噬菌体抗体文库)容易地获得，或者可以合成。dna可以通过化学或通过
340)。
126.使用技术(参见例如us 6596541，regeneron pharmaceuticals，)或任何其他已知的用于产生单克隆抗体的方法，最初分离出具有人可变区和小鼠恒定区的acvr1高亲和力嵌合抗体。技术涉及转基因小鼠的产生，该转基因小鼠的基因组包含有效连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链和轻链可变区，由此小鼠响应抗原刺激将产生包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。分离编码抗体重链和轻链可变区的dna，并有效连接到编码人重链和轻链恒定区的dna。然后在能够表达全人抗体的细胞中表达该dna。
127.通常，用目的抗原攻击小鼠，并从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如b细胞)。淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系，可以筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生对目的抗原特异的抗体的杂交瘤细胞系。可以分离编码重链和轻链可变区的dna，并将其连接到期望的重链和轻链同种型恒定区。这种抗体蛋白质可以在细胞如cho细胞中产生。备选地，可直接从抗原特异性淋巴细胞，分离编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链可变结构域的dna。
128.最初，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下面的实验部分中，针对所希望的特性，包括亲和力、选择性、表位等，对抗体进行表征和选择。用期望的人恒定区替换小鼠恒定区，以产生本发明的全人抗体，例如野生型或经修饰的igg1或igg4。虽然所选择的恒定区可根据具体用途而变，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征取决于可变区。
129.生物等效物
130.本发明的抗acvr1抗体和抗体片段涵盖具有不同于所描述抗体的氨基酸序列但保留结合acvr1蛋白质的能力的蛋白质。在与亲本序列相比时，这类变体抗体和抗体片段包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但表现出基本上等同于所描述抗体的生物学活性。同样，本发明的抗体编码dna序列涵盖与所公开的序列相比包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代的序列，但其编码与本发明的抗体或抗体片段基本生物等效的抗体或抗体片断。
131.如果两种抗原结合蛋白质或抗体是例如在相似实验条件下以相同的摩尔剂量施用(单剂或多剂)时吸收速率和程度未显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则认为它们是生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度上等效但在其吸收速率上不等效，则其可以被认为是等效的或是药物替代物，并且基于如下原因，其仍可以被认为是生物等效的，所述原因包括：吸收速率上的这种差异是有意造成的差异并反映在标签上，对于(例如长期使用)达到有效的体内药物浓度并不是必需的，以及对于所研究的特定药物产品而言被认为是在医学上不重要的。
132.在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白质在其安全性、纯度或功效上不存在临床上有意义的差异，则它们是生物等效的。
133.在一个实施方案中，如果患者可以在参考产品和生物产品之间切换一次或多次，与没有这种切换的持续治疗相比，没有预期的不良反应风险增加，包括免疫原性的临床显著变化或有效性降低，则两种抗原结合蛋白质是生物等效的。
134.在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白质通过(一种或多种)共同的作用机制作用于所使用的一种或多种病症，则就所述机制已知的程度而言，它们是生物等效的。
135.可通过体内和/或体外方法证明生物等效性。生物等效性测量包括，例如：(a)人或其他哺乳动物的体内试验，其中作为时间的函数，测量在血液、血浆、血清或其他生物流体中抗体或其代谢物的浓度；(b)已经与人的体内生物利用度数据相关联并可以合理地预测人体内生物利用度数据的体外试验；(c)人或其他哺乳动物的体内试验，其中作为时间的函数，测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用；和(d)建立抗体的安全性、有效性或生物利用度或生物等效性的良好对照临床试验。
136.本发明抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行多种取代或缺失生物学活性所不需要的末端或内部残基或序列来构建。例如，并非生物学活性所必需的半胱氨酸残基可以缺失或用其他氨基酸取代，以防止在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫键。在其他情况下，生物等效抗体可包括包含氨基酸改变的抗体变体，其中所述氨基酸改变修饰抗体的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。
137.包含fc变体的抗acvr1抗体
138.根据本发明的某些实施方案，提供包含fc结构域的抗acvr1抗体，该fc结构域包含一个或多个突变，该突变增强或减少抗体与fcrn受体的结合，例如与中性ph相比，在酸性ph下的结合。例如，本发明包括抗acvr1抗体，其在fc结构域的ch2或ch3区中包含(一个或多个)突变，其中该突变提高fc结构域在酸性环境中(例如，在ph约5.5至约6.0的内体中)与fcrn的亲和力。在对动物施用时，这类突变可导致抗体的血清半衰期增加。此类fc修饰的非限制性实例包括，例如：位置250(例如，e或q)、250和428(例如l或f)、252(例如l/y/f/w或t)、254(例如s或t)和256(例如s/r/q/e/d或t)处的修饰；或位置428和/或433(例如h/l/r/s/p/q或k)和/或434(例如a、w、h、f或y[n434a、n434w、n434h、n434f或n434y])处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如308f、v308f)和434处的修饰。在一个实施方案中，该修饰包括428l(例如m428l)和434s(例如n434s)修饰；428l、259i(例如v259i)和308f(例如v308f)修饰；433k(例如h433k)和434(例如434y)修饰；252、254和256(例如252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如t250q和m428l)；以及307和/或308修饰(例如308f或308p)。在另一个实施方案中，该修饰包括265a(例如d265a)和/或297a(例如n297a)修饰。
[0139]
例如，本发明包括包含fc结构域的抗acvr1抗体，该fc结构域包含选自以下的一或多对或多组突变：250q和248l(例如t250q和m248l)；252y、254t和256e(例如m252y、s254t和t256e)；428l和434s(例如m428l和n434s)；257i和311i(例如p257i和q311i)；257i和434h(例如p257i和n434h)；376v和434h(例如d376v和n434h)；307a、380a和434a(例如t307a、e380a和n434a)；以及433k和434f(例如h433k与n434f)。上述fc结构域突变和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的所有可能的组合都在本发明的范围之内。
[0140]
本发明还包括包含嵌合重链恒定(ch)区的抗acvr1抗体，其中该嵌合ch区包含源自一种以上免疫球蛋白同种型的ch区的区段。例如，本发明的抗体可包含嵌合ch区，该嵌合ch区包含源自人igg1、人igg2或人igg4分子的ch2结构域的一部分或全部，与源自人igg1、人igg2或人igg4分子的ch3结构域的一部分或全部组合。根据某些实施方案，本发明的抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合ch区。例如，嵌合铰链可包含源自人igg1、人igg2或人igg4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据eu编号，位置216至227的氨基酸残基)，与源自人igg1、人igg2
或人igg4铰链区的“下铰链”序列(根据eu编号，位置228至236的氨基酸残基)组合。根据某些实施方案，该嵌合铰链区包含源自人igg1或人igg4上铰链的氨基酸残基和源自人igg2下铰链的氨基酸残基。在某些实施方案中，包含本文所述嵌合ch区的抗体可显示经修饰的fc效应子功能，而不对抗体的治疗特性或药代动力学特性产生不利影响。(参见例如美国专利申请公开2014/0243504，其公开内容在此以其整体引入作为参考)。
[0141]
抗体的生物学特征
[0142]
一般而言，本发明的抗体通过结合acvr1蛋白并降低其活性而起作用。例如，本发明包括抗体和抗体的抗原结合片段，其中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式，通过表面等离子体共振测量，所述抗体和抗原结合片段以小于500nm的kd结合人acvr1蛋白(例如，在25℃下或在37℃下)。
[0143]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，通过表面等离子体共振测量，所述抗体和抗原结合片段以小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约50nm、小于约25nm、小于约10nm、小于约5nm、小于约3nm、小于约2nm、小于约1nm的kd结合acvr1。在某些实施方案中，本发明提供分离的抗acvr1抗体或其抗原结合片段，其是全人单克隆抗体。
[0144]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在25℃下以小于60nm、小于12nm、小于2nm、小于1nm或小于0.5nm的解离常数(kd)结合与fc融合的人acvr1胞外结构域(例如，seq id no:339)。
[0145]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在37℃下以小于150nm、小于15nm、小于5nm、小于1.5nm或小于1nm的解离常数(kd)结合与mfc融合的人acvr1胞外结构域(seq id no:339)。
[0146]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在25℃下以小于300nm、小于150nm、小于25nm、小于10nm、小于5nm、小于3nm或小于2nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸融合的人acvr1胞外结构域(例如，seq id no:338)。
[0147]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在37℃下以小于500nm、小于50nm、小于25nm、小于10nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸融合的人acvr1胞外结构域(例如，seq id no:338)。
[0148]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段不结合小鼠acvr1。
[0149]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在25℃下以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如，seq id no:338)。
[0150]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例3中定义的测定形式或基本相似的测定，在表面等离子体共振测定中测量，该抗体或其抗原结合片段在37℃下以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如，seq id no:340)。本发明还包
括抗体或其抗原结合片段，其中例如使用本文实施例5中定义的测定形式或基本相似的测定，所述抗体或其抗原结合片段与表达人acvr1蛋白或人acvr(r206h)蛋白的细胞结合。
[0151]
在某些实施方案中，在基于细胞的生物测定中，例如使用本文实施例6中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段以小于25nm的ic
50
抑制人激活蛋白a对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活。
[0152]
在某些实施方案中，在基于细胞的生物测定中，例如使用本文实施例6中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段以小于20nm、小于5nm、小于3nm或小于1nm或更小的ic
50
抑制人bmp7对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活。
[0153]
本发明还包括抗体或其抗原结合片段，其中，例如使用本文实施例7中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时显著降低血清铁调素。
[0154]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例7中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时显著提高血清铁水平。
[0155]
在某些实施方案中，例如使用本文实施例7中定义的测定形式或基本相似的测定，该抗体或其抗原结合片段在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时抑制野生型acvr1信号传导。
[0156]
在某些实施方案中，本发明的抗acvr抗体或其抗原结合片段显著减弱野生型小鼠创伤后ho模型(例如，如本文实施例8中所述模型，或基本相似的模型)中的异位骨化(ho)。
[0157]
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合片段特异性结合人acvr1、其片段或其突变体，并包含含有选自表1中所列的hcvr序列的氨基酸序列的hcvr，以及含有选自表1中所列的lcvr序列的氨基酸序列的lcvr。
[0158]
在一个实施方案中，本发明提供分离的重组抗体或其抗原结合片段，其特异性结合acvr1蛋白并抑制acvr1介导的骨形态发生蛋白(bmp)信号转导，其中该抗体或其片段表现出以下一个或多个特征：(a)是全人单克隆抗体；(b)在25℃下在表面等离子体共振测定中测量，以小于60nm、小于12nm、小于2nm、小于1nm或小于0.5nm的解离常数(kd)结合与fc融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:339)；(c)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量，以小于150nm、小于15nm、小于5nm、小于1.5nm或小于1nm的解离常数(kd)结合与mfc融合的人acvr1胞外结构域(seq id no:339)；(d)在25℃下在表面等离子体共振测定中测量，以小于300nm、小于150nm、小于25nm、小于10nm、小于5nm、小于3nm或小于2nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:338)；(e)在37℃下在表面等离子体共振测定中测量，以小于500nm、小于50nm、小于25nm、小于10nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的人acvr1胞外结构域(例如seq id no:338)；(f)不结合小鼠acvr1，或在25℃下在表面等离子体共振测定中测量时以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如seq id no:340)；(g)不结合小鼠acvr1，或在37℃下在表面等离子体共振测定中测量时以大于500nm的kd结合与myc-myc-六组氨酸标签融合的小鼠acvr1胞外结构域(例如seq id no:340)；(k)结合表达人acvr1蛋白或人acvr(r206h)蛋白的细胞；(l)在基于细胞的生物测定中测量，以小于25nm的ic
50
抑制人激活蛋白a对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活；(m)在基于细胞的生物测定中测量，以小于20nm、小
于5nm、小于3nm或小于1nm或小于的ic
50
抑制人bmp7对表达人acvr1(r206h)的细胞的激活；(m)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时显著降低血清铁调素；(n)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时显著提高血清铁水平；和/或(o)在对表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠施用时抑制野生型acvr1信号传导；和(p)包含含有选自表1中所列的hcvr序列的氨基酸序列的hcvr和含有选自表1中所列的lcvr序列的氨基酸序列的lcvr。
[0159]
本发明的抗体可具有一种或多种上述生物学特征或其任何组合。本发明抗体的其他生物学特征对于本领域普通技术人员将从本公开(包括本文的工作实施例)的阅读中显而易见。
[0160]
表位作图及相关技术
[0161]
本发明包括与acvr1蛋白分子的一个或多个区域内的一个或多个氨基酸相互作用的抗acvr1抗体。与抗体结合的表位可由位于acvr1蛋白分子的任何前述结构域内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单个连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。备选地，表位可以由位于该蛋白质分子的一个或两个上述结构域内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如构象表位)。
[0162]
本领域普通技术人员已知的多种技术可用于确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规交叉阻断测定，如antibodies,harlow和lane(cold spring harbor press,cold spring harbor,ny)中所述。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke(2004)methods mol.biol.248:443-63)、肽切割分析、晶体研究和nmr分析。此外，可以采用表位切除、表位提取和抗原化学修饰等方法(tomer(2000)prot.sci.9:487-496)。可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内氨基酸的另一种方法是，通过质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及氘标记目的蛋白，然后使抗体结合氘标记的蛋白。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子将比并非组成该界面一部分的氨基酸内的可交换质子以更慢的速率发生氘-氢反交换。结果，形成蛋白质/抗体界面一部分的氨基酸可以保留氘，因此与不包括在该界面中的氨基酸相比，将显示相对较高的质量。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示对应于与抗体相互作用的具体氨基酸的氘标记残基。参见例如ehring(1999)analytical biochemistry 267:252-259；engen和smith(2001)anal.chem.73:256a-265a。
[0163]
术语“表位”是指与b和/或t细胞反应的抗原上的位点。b细胞表位可由连续氨基酸形成或由通过蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常丢失。表位通常包括具有独特空间构象的至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。
[0164]
修饰辅助分析(map)也称为基于抗原结构的抗体分析(asap)，是根据每种抗体与化学或酶学修饰的抗原表面的结合性质的相似性，对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mab)进行分类的方法(参见us 2004/0101920，在此以其整体明确引入作为参考)。每个类别可以反映与另一类别所代表的表位明显不同或部分重叠的独特表位。此技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，从而可以将表征集中在遗传上不同的抗体上。在应用于杂交瘤筛选时，map可利于鉴定产生具有期望特征的mab的稀有杂交瘤克隆。map可用于将本发明的抗体
分类为结合不同表位的抗体组。
[0165]
在某些实施方案中，本发明包括抗acvr1抗体及其抗原结合片段，其与acvr1胞外结构域中的一个或多个表位相互作用。该一个或多个表位可由位于acvr1胞外结构域中的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的一个或多个连续序列组成。备选地，该表位可由位于acvr1蛋白内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
[0166]
本发明包括与表1中所列的任何具体示例性抗体结合相同表位或表位部分的抗acvr1抗体。同样，本发明还包括与表1中所列的任何具体示例抗体竞争结合acvr1蛋白或其片段的抗acvr1抗体。例如，本发明包括抗acvr1抗体，其与表1中所列的一种或多种抗体交叉竞争结合acv蛋白。
[0167]
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗acvr1抗体结合相同的表位，或与参考抗acvr1抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明的参考抗acvr1抗体结合相同的表位，允许参考抗体在饱和条件下结合acvr1蛋白或肽。接下来，评估测试抗体结合acvr1蛋白分子的能力。如果在参考抗acvr1抗体饱和结合后测试抗体能够与acvr1结合，则可以得出结论，测试抗体与参考抗acvr1抗体结合不同的表位。另一方面，如果在参考抗acvr1抗体饱和结合后测试抗体不能与acvr1蛋白结合，则测试抗体可以结合与本发明的参考抗acvr1抗体相同的表位。
[0168]
为了确定抗体是否与参考抗acvr1抗体竞争结合，在两个方向上进行上述结合方法：在第一个方向上，允许参考抗体在饱和条件下结合acvr1蛋白，然后评估测试抗体与acvr1分子的结合。在第二个方向上，允许测试抗体在饱和条件下结合acvr1分子，然后评估参考抗体与acvr1分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗体能够与acvr1分子结合，则得出结论，测试抗体和参考抗体竞争结合acvr1。如本领域普通技术人员将理解，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定结合与参考抗体相同的表位，而可能通过结合重叠或相邻的表位来在空间上阻断参考抗体的结合。
[0169]
如果两种抗体相互竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。也就是说，如在竞争结合测定中测量(参见例如junghans等,cancer res.1990 50:1495-1502)，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合，达到至少50％、但优选75％、90％或甚至99％。备选地，如果抗原中导致一种抗体的结合减少或消除的基本上所有氨基酸突变也导致另一种抗体的结合减少或消除，则这两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则这两种抗体具有重叠表位。
[0170]
然后可以进行附加的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认观察到的测试抗体结合的缺乏实际上是否是由于结合了与参考抗体相同的表位引起，还是空间阻断(或其他现象)是造成所观察到的结合缺乏的原因。这类实验可以使用elisa、ria、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定法进行。
[0171]
免疫缀合物
[0172]
本发明包括与治疗部分缀合的人抗acvr1单克隆抗体(“免疫缀合物”)，用于治疗acvr1相关疾病或病症(例如贫血或异位骨化)。本文所用的术语“免疫缀合物”是指与放射活性剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、肽或蛋白质或治疗剂化学连接或生物连接
的抗体。只要能够与其靶标结合，抗体可以在沿着分子的任何位置上与放射活性剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶、肽或治疗剂连接。免疫缀合物的实例包括抗体-药物缀合物和抗体-毒素融合蛋白。在一个实施方案中，该活性剂可以是针对acvr1蛋白的第二种不同抗体。可与抗acvr1抗体缀合的治疗部分的类型，将考虑待治疗的病症和所希望达到的治疗效果。用于形成免疫缀合物的合适活性剂的实例为本领域已知；参见例如wo 05/103081。
[0173]
多特异性抗体
[0174]
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性抗体。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位特异，或者可以包含对一种以上靶多肽特异的抗原结合结构域。参见例如tutt等,1991,j.immunol.147:60-69；kufer等,2004,trends biotechnol.22:238-244。
[0175]
本发明的任何多特异性抗原结合分子或其变体都可使用本领域普通技术人员已知的标准分子生物学技术(例如，重组dna和蛋白质表达技术)构建。
[0176]
在一些实施方案中，acvr1特异性抗体以双特异性型式(“双特异性”)产生，其中将结合acvr1蛋白不同结构域的可变区连接在一起，以在单个结合分子内赋予双结构域特异性。适当设计的双特异性分子可通过提高特异性和结合亲和力两者来增强总体的acvr1蛋白抑制功效。对不同的结构域(例如，n端结构域的区段)具有特异性的可变区、或可结合一个结构域内的不同区域的可变区，可以在结构支架上配对，该结构支架允许每个区域同时结合单独的表位、或结合一个结构域内的不同区域。在双特异性分子的一个实例中，将来自对一个结构域具有特异性的结合剂的重链可变区(vh)，与来自对第二结构域具有特异性的一系列结合剂的轻链可变区重组，以鉴定出可与原始vh配对而不破坏该vh的原始特异性的非关联v
l
配偶体。这样，单个v
l
区段(例如，v
l
1)可以与两个不同的vh结构域(例如，vh1和vh2)组合，以产生由两个结合“臂”(vh1-v
l
1和vh1-v
l
1)组成的双特异性分子。单个v
l
区段的使用降低了系统的复杂性，从而简化并提高了用于产生双特异性分子的克隆、表达和纯化过程的效率(参见例如us2011/0195454和us2010/0331527)。
[0177]
备选地，结合一个以上结构域和第二靶的抗体，例如但不限于，第二种不同的抗acvr1抗体，可以使用本文所述的技术或本领域技术人员已知的其他技术，以双特异性型式制备。结合不同区域的抗体可变区可以与结合例如acvr1胞外结构域上的相关位点的可变区连接在一起，以在单个结合分子内赋予双重抗原特异性。具有这种性质的适当设计的双特异性分子将具有双重功能。可以将对胞外结构域具有特异性的可变区，与对胞外结构域以外具有特异性的可变区组合，并在允许每个可变区结合单独抗原的结构支架上配对。
[0178]
可用于本发明中的一个示例性双特异性抗体型式，涉及使用第一免疫球蛋白(ig)ch3结构域和第二ig ch3结构体，其中该第一和第二ig ch3结构域至少有一个氨基酸彼此不同，并且其中与缺乏该氨基酸差异的双特异性抗体相比，该至少一个氨基酸差异减少了该双特异性抗体与蛋白a的结合。在一个实施方案中，该第一ig ch3结构域结合蛋白a，第二ig ch3结构域包含减少或消除蛋白a结合的突变，例如h95r修饰(按imgt外显子编号；按eu编号为h435r)。该第二ch3可进一步包含y96f修饰(按imgt；按eu为y436f)。可存在于该第二ch3中的其他修饰包括：在igg1抗体的情况下，d16e、l18m、n44s、k52n、v57m和v82i(按imgt；按eu为d356e、l358m、n384s、k392n、v397m和v42i通过eu)；在igg2抗体的情况下，n44s、k52n和v82i(按imgt；按eu为n384s、k392n和v422i)；以及在igg4抗体的情况下，q15r、n44s、k52n、
v57m、r69k、e79q和v82i(通过imgt；按eu为q355r、n384s、k392n、v397m、r409k、e419q和v422i)。在本发明的范围内考虑上述双特异性抗体型式的变化。
[0179]
可在本发明中使用的其他示例性双特异性型式包括但不限于，例如，基于scfv的型式或双链抗体双特异性型式、igg-scfv融合、双可变结构域(dvd)-ig、四源杂交瘤(quadroma)、杵入臼、共同轻链(例如，共同轻链组合杵入臼等)、crossmab、crossfab、(seed)体、亮氨酸拉链、duobody、igg1/igg2、双作用fab(daf)-igg和mab2双特异性型式(上述型式的综述参见例如klein等2012,mabs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸缀合来构建，例如，其中可以使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后其自组装为具有确定的组成、价态和几何形状的多聚复合物。(参见例如kazane等,j.am.chem.soc.[epub:dec.4,2012])。
[0180]
治疗施用和制剂
[0181]
本发明提供包含本发明的抗acvr1抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本发明的治疗组合物将与合适的载体、赋形剂和其它试剂一起施用，将该载体、赋形剂和其它试剂掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受性等。多种合适的制剂可见于所有药物化学家已知的制剂集中：remington's pharmaceutical sciences,mack publishing company,easton,pa。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶、蜡、油、脂质、含囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如lipofectin
tm
)、dna缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳液碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含碳蜡的半固体混合物。还参见powell等"compendium of excipients for parenteral formulations"pda
·
(1998)j pharm sci technol 52:238-311。
[0182]
抗体的剂量可根据待施用个体的年龄和体型、目标疾病、病症、施用途径等而变化。在本发明的抗体用于治疗成人患者的疾病或病症或用于预防此类疾病时，有利的是通常以约0.1至约100mg/kg体重的单剂量施用本发明抗体。根据病症的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可作为至少约0.1mg至约800mg、约1至约600mg、约5至约500mg或约10至约400mg的初始剂量施用。在某些实施方案中，初始剂量之后可按这样的量施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，该量可近似等于或小于初始剂量，其中后续剂量间隔至少1天至3天、至少一周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少12周或至少14周。
[0183]
多种递送系统是已知的，可用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体包封、微粒、微囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见例如wu等(1987)j.biol.chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、经皮、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、脑室内和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或黏膜皮肤衬里(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身施用的或局部施用。药物组合物也可以以囊泡，尤其是脂质体的形式递送(参见例如langer(1990)science 249:1527-1533)。
[0184]
本文还考虑使用纳米颗粒递送本发明的抗体。抗体缀合的纳米颗粒可用于治疗和诊断应用。arruebo,m.等2009(“antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications”in j.nanomat.2009卷,文章id 439389,24页,doi:10.1155/2009/439389)
详细描述了抗体缀合的纳米颗粒及其制备和使用方法，其在此引入作为参考。可以开发纳米颗粒并将其与药物组合物中包含的抗体缀合以靶向细胞。用于药物递送的纳米颗粒也已在例如us 8257740或us8246995中描述，在此以其整体引入作为参考。
[0185]
在某些情况下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。在另一个实施方案中，可将控制释放系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
[0186]
可注射制剂可包括用于静脉注射、皮下注射、颅内注射、腹腔注射和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。
[0187]
本发明的药物组合物可使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，注射笔递送装置易用于递送本发明的药物组合物。这种注射笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的注射笔递送装置通常使用包含药物组合物的可替换药筒。一旦药筒内的所有药物组合物都已施用并且药筒排空，空药筒即可以容易地丢弃并用包含药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用注射笔递送装置。在一次性注射笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性注射笔递送装置预先填充有保持在装置内的容器中的药物组合物。一旦容器中的药物组合物排空，整个装置即可丢弃。
[0188]
在治疗dipg时，可能有必要克服血脑屏障。在某些实施方案中，通过使用本领域例如parodi等2019,pharmaceutics 11:245中公开的一种或多种方法来克服血脑屏障。
[0189]
有利地，上述口服或胃肠外使用的药物组合物，以适合活性成分剂量的单位剂量，制备成剂型。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含抗体的量通常为每个单位剂量的剂型中约5至约500mg；尤其是在注射液的形式中，优选的是，抗体以约5至约300mg的量包含在内，而对于其它剂型，抗体以10至约300mg的量包含在内。
[0190]
抗体的治疗用途
[0191]
本发明的抗体可用于治疗和/或预防与acvr1相关的疾病或病症和/或用于改善与这种疾病、病症或病情相关的至少一种症状。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以按治疗剂量对患有与acvr1或突变体acvr蛋白相关的疾病或病症或病情的患者施用。
[0192]
在某些实施方案中，本发明的抗体可用于治疗或预防acvr1相关或acvr1突变体蛋白相关疾病或病症的至少一种症状或指征，该疾病或病症选自异位骨化、异常骨化、骨发育不良、贫血和弥漫性内生型桥脑胶质瘤。
[0193]
本文还考虑将本发明的一种或多种抗体预防性地用于有风险患acvr1相关疾病或病症的个体。
[0194]
在本发明的一个实施方案中，本发明抗体用于制备药物组合物或药物，用于治疗患有本文公开的疾病、病症或病情的患者。在本发明的另一个实施方案中，本发明抗体用作辅助治疗，与本领域技术人员已知用于治疗或改善本文公开的疾病、病症或病情的任何其他活性剂或任何其他治疗联合使用。
[0195]
联合治疗
[0196]
联合治疗可包括本发明的抗体以及可有利地与本发明抗体或本发明抗体的生物活性片段组合的任何其他治疗剂。本发明的抗体可与用于治疗acvr1相关或acvr1突变体蛋
白相关疾病或病症的一种或多种药物或治疗协同组合。在一些实施方案中，本发明的抗体可与第二治疗剂组合以改善所述疾病或病症的一种或多种症状。
[0197]
取决于疾病、病症或病情，本发明的抗体可与一种或多种其他治疗剂组合使用。
[0198]
可与抗acvr1抗体组合施用的、用于异位骨化的其他治疗药物的实例可包括但不限于抗激活蛋白a抑制剂或其抗原结合片段、抗acvr2抗体或其抗原结合片段、抗炎药、类固醇、二膦酸盐、肌肉松弛剂和视黄酸受体(rar)γ激动剂。
[0199]
激活蛋白属于转化生长因子β(tgf-β)超家族，对细胞增殖、分化、代谢、稳态和凋亡以及免疫应答和组织修复具有广泛的生物学效应。激活蛋白a是一种二硫键连接的同二聚体(两条β-a链)，其结合并激活i型(act ri-a和act ri-b)和ii型(actrii-a和act rii-b)丝氨酸-苏氨酸激酶受体的异聚体复合物。激活蛋白a可以作为acvr1蛋白或acvr1突变体蛋白的配体发挥作用。
[0200]
抗炎药的实例包括阿司匹林(aspirin)、双氯芬酸(diclofenac)、吲哚美辛(indomethacin)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、吡罗昔康(piroxicam)、罗非昔布(rofecoxib)、塞来昔布(celecoxib)、硫唑嘌呤(azathioprine)、青霉胺(penicillamine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、英夫利昔单抗(infliximab)和依那西普(etanercept)。类固醇的实例包括泼尼松龙(prednisolone)、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、氟替卡松(fluticasone)、地塞米松(dexamethasone)和氢化可的松(hydrocortisone)。二膦酸盐的实例可包括阿伦膦酸盐(alendronate)、斯孟膦酸盐(cimadronate)、氯膦酸盐(clodronate)、依替膦酸钠(etidronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、英卡膦酸盐(incadronate)、米诺膦酸盐(minodronate)、奈立膦酸钠(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpadronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、piridronate、利塞膦酸盐(risedronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)以及唑来膦酸盐(zoledronate)。肌肉松弛剂的实例包括环苯扎林(cyclobenzaprine)、美他沙酮(metaxalone)和巴氯芬(baclofen)。视黄酸受体γ激动剂的实例可包括帕洛罗汀(palovarotene)。用于贫血的其他治疗药物的实例可包括重组促红细胞生成素(epo)和铁补充剂。弥漫性内生型桥脑胶质瘤的其他治疗方法的实例包括放射治疗或实验性化疗。
[0201]
本文所用的术语“与
…
组合”是指，可在施用本发明的抗acvr1抗体之前、同时或之后施用(一种或多种)其他治疗活性成分。术语“与
…
组合”还包括抗acvr1抗体和第二治疗剂的顺次或同时施用。
[0202]
在施用本发明的抗acvr1抗体之前，可对个体施用(一种或多种)其他治疗活性成分。例如，如果第一成分在第二成分施用前1周、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时、12小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或少于30分钟施用，则第一成分可以视为在第二成分“之前”施用。在其他实施方案中，可以在施用本发明的抗acvr1抗体之后对个体施用(一种或多种)其他治疗活性成分。例如，如果第一成分在第二成分施用后30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时或更长时间施用，则第一成分可以视为在第二成分“之后”施用。在其他实施方案中，可以与施用本发明的抗acvr1抗体同时地对个体施用(一种或多种)其他治疗活性成分。为了本发明的目的，“同时”施用包括，例如，在单个剂型中、或在分开的剂型中在相互间隔约30
分钟或更短的时间内，对个体施用抗acvr1抗体和其他治疗活性成分。如果以分开的剂型施用，则每种剂型可以通过相同的途径施用(例如，抗acvr1抗体和所述其他治疗活性成分都可以通过静脉内施用等)；备选地，每种剂型可以通过不同的途径施用(例如，抗acvr1抗体可以静脉内施用，而其他治疗活性成分可以口服施用)。在任何情况下，为了本公开的目的，在单一剂型中施用这些成分、在分开的剂型中通过相同途径施用这些成分、或在分开的剂型中通过不同途径施用这些成分，均视为“同时施用”。为了本公开的目的，在施用其他治疗活性成分“之前”、“同时”或“之后”(如上文中定义的术语)施用抗acvr1抗体，视为抗acvr1抗体与“其他治疗活性成分”组合施用。
[0203]
本发明包括这样的药物组合物，其中本发明的抗acvr1抗体与本文其他地方所述的一种或多种其他治疗活性成分共同配制。
[0204]
抗体的诊断用途
[0205]
本发明的抗体可用于检测和/或测量样品中的acvr1蛋白，例如用于诊断目的。一些实施方案考虑在测定试验中使用本发明的一种或多种抗体以检测acvr1相关或acvr突变体蛋白相关疾病或病症。acvr1的示例性诊断测定可包括，例如，使从患者获得的样品与本发明的抗acvr1抗体接触，其中该抗acvr1抗体用可检测标记或报告分子标记，或用作捕获配体以选择性地从患者样品中分离acvr1。备选地，未标记的抗acvr1抗体可与自身可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，如3h、
14
c、
32
p、
35
s或
125
i；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中acvr1的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)和荧光激活细胞分选(facs)。
[0206]
可用于本发明的acvr1诊断测定中的样品包括可从患者获得的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下含有可检测量的acvr1蛋白或其片段。通常，将测量从健康患者(例如，未患acvr1相关疾病的患者)获得的特定样品中的acvr1蛋白水平，以初步建立acvr1的基线或标准水平。然后可以将acvr1的此基线水平，与从疑似具有acvr1相关病症或具有该病症相关症状的个体获得的样品中测量的acvr1水平，进行比较。
[0207]
对acvr1蛋白特异性的抗体可以不包含附加的标记或部分，或者它们可以包含n端或c端标记或部分。在一个实施方案中，该标记或部分是生物素。在结合测定中，标记(如果存在)的位置可以确定该肽相对于该肽所结合的表面的取向。例如，如果表面包被抗生物素蛋白，则含有n端生物素的肽将取向，以使得肽的c端部分远离所述表面。
实施例
[0208]
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并非旨在限制发明人认为其发明的范围。已努力确保所用数字(如量、温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则分数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，室温为约25℃，压力等于或接近大气压。
[0209]
实施例1：产生抗激活蛋白a受体1(acvr1)的人抗体
[0210]
在包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的dna的小鼠中产生抗acvr1蛋白的人抗体。用包含人acvr1蛋白胞外结构域(例如seq id no:339)的免疫原免疫小鼠。
[0211]
通过acvr1特异性免疫测定试验，监测抗体免疫应答。在达到所希望的免疫应答时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保持其生存能力并形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系，以鉴定产生acvr1特异性抗体的细胞系。细胞系用于获得若干抗acvr1嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。
[0212]
还按美国专利7582298中所述，直接从抗原阳性小鼠b细胞，分离了抗acvr1抗体而不与骨髓瘤细胞融合，该专利在此明确以其整体引入作为参考。使用此方法，获得了若干全人抗acvr1抗体(即，具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)。
[0213]
将按上文所公开产生的示例性抗体命名为mab27396、mab27241、mab27242、mab27243、mab27245、mab27247、mab27404、mab27405、mab27400、mab22124、mab22125、mab22168、mab29226、mab29226、mab29237、mab29256、mab29257、mab29261、mab29266、mab22115。
[0214]
按照本实施例的方法产生的示例性抗体的生物学特性在下文所述的实施例中详细描述。
[0215]
实施例2：重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列
[0216]
表1列出了本发明所选择的抗acvr1抗体的重链和轻链可变区以及cdr的氨基酸序列标识符。
[0217]
表1：氨基酸序列标识符
[0218][0219]
表2中列出了相应的核酸序列标识符。
[0220]
表2：核酸序列标识符
[0221][0222]
本文中提到的抗体典型地具有全人可变区，但可以具有人或小鼠恒定区。如本领域普通技术人员将理解，具有特定fc同种型的抗体可以转化为具有不同fc同种型的抗体(例如，具有小鼠igg1 fc的抗体可以转化为具有人igg4的抗体等)，但在任何情况下，可变结构域(包括cdr)——由表1或表2中所示的数字标识符表示——将保持不变，并且与抗原的结合特性预期相同或基本相似，无论fc结构域的性质如何。在某些实施方案中，将具有小鼠igg1 fc的选定抗体转化为具有人igg4 fc的抗体。在一个实施方案中，如us20100331527中所公开，igg4 fc结构域包含2个或多个氨基酸改变。在一个实施方案中，人igg4 fc在铰链区中包含丝氨酸到脯氨酸突变(s108p)，以促进二聚体稳定化。除非另有说明，以下实施例中使用的所有抗体均包含人igg4同种型。
[0223]
表3列出了本发明所选择的抗acvr1抗体的重链和轻链(hc和lc)的核酸(dna)和氨基酸(pep)序列标识符。
[0224]
表3.重链和轻链的序列标识符
[0225][0226]
实施例3：通过表面等离子体共振测定抗体与acvr1的结合
[0227]
实验流程
[0228]
使用实时表面等离子体共振生物传感器(spr biacore)biacore 4000，测定了acvr1与纯化的抗acvr1单克隆抗体结合的平衡解离常数(kd)。所有结合研究均在25℃和37℃下在10mm hepes、150mm nacl、3mm edta和0.05％v/v表面活性剂吐温-20、ph 7.4(hbs-et)运行缓冲液中进行。biacore cm5传感器表面首先用单克隆小鼠抗人fc抗体(ge，#br-1008-39或regn2567)通过胺偶联衍生，以捕获抗acvr1单克隆抗体。首先在hbs-et运行缓冲液中制备不同浓度的acvr1试剂，带c端myc-myc-六组氨酸标签表达的人acvr1胞外结构域(hacvr1-mmh；seq id no:338)、带c端myc-myc-六组胺标签表达的小鼠acvr1胞外结构域(macvr1-mmh；seq id no:340)、带c末端小鼠igg2a fc标签表达的人acvr1胞外结构域(hacvr1-mfc；seq id no:339)(900nm-3.7nm；3倍系列稀释)。然后将acvr1试剂以30μl/分钟的流速注射到抗人fc捕获的抗acvr1单克隆抗体表面2.5-3分钟，同时在hbs-et运行缓冲
液中监测单克隆抗体结合的acvr1试剂的解离10-15分钟。通过使用scrubber 2.0c曲线拟合软件，将实时传感图拟合到1:1结合模型，来确定动力学结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)：
[0229][0230]
结果
[0231]
表4至表9中显示25℃和37℃下不同acvr1试剂与本发明的抗acvr1单克隆抗体的结合动力学参数。
[0232]
表4：25℃下hacvr1-mmh与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0233][0234][0235]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合。
[0236]
表5：37℃下hacvr1-mmh与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0237][0238][0239]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合
[0240]
#ic表示结合数据不确定
[0241]
表6：25℃下hacvr1-mfc与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0242][0243]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合。
[0244]
表7：37℃下hacvr1-mfc与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0245][0246]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合。
[0247]
#ic表示结合数据不确定
[0248]
表8：25℃下macvr1-mmh与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0249]
[0250][0251]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合。
[0252]
#ic表示结合数据不确定。
[0253]
表9：37℃下macvr1-mmh与抗acvr1单克隆抗体结合的结合动力学参数
[0254]
[0255][0256]
*nb表示在当前实验条件下未观察到结合。
[0257]
#ic表示结合数据不确定。
[0258]
在25℃下，与hacvr1-mmh结合的抗acvr1单克隆抗体的kd值范围为1.56nm至1.97μm，如表4中所示。在37℃下，与hacvr1-mmh结合的抗acvr1单克隆抗体的kd值范围为5.77nm至438nm，如表5中所示。
[0259]
在25℃下，与hacvr1-mfc结合的抗acvr1单克隆抗体的kd值范围为0.20nm至55.4nm，如表6中所示。在37℃下，与hacvr1-mfc结合的抗acvr1单克隆抗体的kd值范围为0.67nm至145nm，如表7中所示。
[0260]
在25℃下，与macvr1-mmh结合的抗acvr1单克隆抗体的kd值范围为171nm至2.13μm，如表8中所示。在37℃下，只有一种抗acvr1单克隆抗体与macvr1-mmh结合，kd值为504nm，如表9中所示。
[0261]
实施例4：不同抗acvr1单克隆抗体之间的交叉竞争
[0262]
实验流程
[0263]
在octet htx生物传感器平台(pall fortebio corp.)上，使用实时无标记生物层干涉测定法，测定了一系列抗acvr1单克隆抗体的结合竞争。整个实验在25℃下在10mm hepes、150mm nacl、3mm edta和0.05％v/v表面活性剂吐温-20、1mg/ml bsa、ph7.4(hbs-ebt)缓冲液中进行，平板以1000rpm的速度摇动。为了评估两种抗体是否能够相互竞争结合它们各自的表位，首先浸渍抗his抗体包被的octet生物传感器尖端(fortebio inc,#18-5079)，通过将所述生物传感器尖端浸没在含有10μg/ml hacvr1-mmh的孔中40秒，以捕获表达带有c端myc-myc-六组氨酸标签的人acvr1胞外结构域(hacvr1-mmh；seq id no:338)。然后通过浸入含有50μg/ml mab-1溶液的孔中4分钟，用第一种抗acvr1单克隆抗体(称为mab-1)饱和该抗原捕获的生物传感器尖端。然后将生物传感器尖端浸入含有50μg/ml第二种抗acvr1单克隆抗体(称为mab-2)溶液的孔中3分钟。在每个实验步骤之间，在hbs-ebt缓冲液中洗涤生物传感器尖端。在整个实验期间监测实时结合反应，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较了mab-2结合与mab-1复合的hacvr1-mmh的反应，确定了不同抗acvr1单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表10所示。
[0264]
结果
[0265]
表10：抗acvr1单克隆抗体之间的交叉竞争
[0266]
[0267]
[0268][0269]
表10显示所选择的抗acvr1抗体之间的交叉竞争。
[0270]
实施例5：通过流式细胞术测试与hek293/hacvr1 wt和hek293/hacvr1-r206h细胞的细胞结合
[0271]
为了评估抗hacvr1抗体与细胞的结合，产生了两种细胞系，以在hek293细胞中稳定过量表达全长hacvr1、以及与萤火虫荧光素酶报告分子(bre-luc)融合的bmp反应元件。一个细胞系包含hacvr1的野生型版本(登录号#q04771的氨基酸1-509)，命名为hek293/bre-luc/hacvr1-野生型。下文中称为hek293/hacvr1-wt。另一个细胞系包含hacvr1(r206h)。分离此细胞系的单克隆，将得到的细胞系命名为hek293/bre-luc/hacvr1-r206h-克隆h2。下文中称为hek293/hacvr1-r206h。
[0272]
为了评估本发明的抗acvr1抗体与细胞表面表达的受体的结合，将66.6nm或70nm抗体与0.5x106细胞/孔在4℃下在含有2％fbs的pbs(不含钙和镁)中孵育30分钟。在与一抗孵育后，用3.2μg/ml的alexa-647缀合二抗(jackson immunoresearch laboratories inc.,抗人#109-607-003)在4℃下染色细胞25或30分钟。使用bd cytofix
tm
(becton dickinson,#554655)固定细胞，并在或流式细胞仪上进行分析。还测试了所有细胞系的未染色和单独二抗对照。使用软件分析结果，以确定活细胞的荧光几何平均值，并通过相应未染色细胞的几何平均值归一化测试条件的几何平均值来计算结合率。
[0273]
表11：抗hacvr1抗体与hek293/bre-luc/hacvr1细胞的结合
[0274][0275]
如表11中所示，本发明的20种抗hacvr1抗体中的4种显示与hek293/hacvr1-wt细胞结合，结合率为4至183倍。测试了本发明的全部20种抗hacvr1抗体与hek293/hacvr1-r206h细胞的结合，它们显示与细胞结合，结合率为2-1900倍。本发明的抗hacvr1抗体显示与hek293亲本细胞结合，结合率为1至26倍。同种型对照抗体和单独二抗样品显示了1至3倍的结合率。
[0276]
实施例6：使用hek293/bre-luc/hacvr1-r206h-克隆h2细胞、通过hbmp7或hactivin a激活，在基于细胞的生物测定中测定acvr1的功能抑制
[0277]
激活蛋白a受体i型acvr1(也称为actri、acvr1a或alk2)是一种单跨膜受体，是tgf-β受体超家族i型bmp受体的成员。配体结合后，acvr1与ii型受体一起启动下游信号传
导级联，导致受体特异性r-smad蛋白(smad1、smad5或smad8)激活，并协同smad(smad4)，导致基因转录调节(massagu
é
j,tgf-beta signal transduction,annu.rev.biochem.1998.67:753
–
91,pmid:9759503；massagu
é
等smad transcription factors,genes dev.2005 19:2783-2810,pmid:16322555)。为了评估抗acvr1抗体对acvr1(r206h)(见于fop中的突变(shore等,nat genet.2006may；38(5):525-7.epub 2006年4月23日.pmid:16642017))的抑制，在hek293细胞(人胚肾细胞，atcc)中建立了生物测定。hek293细胞内源表达acvr1、必要的ii型受体、smad蛋白和形成功能性bmp信号传导途径的其他成分。为了驱动通过acvr1的信号传导，产生了稳定过量表达全长人acvr1(登录号#q04771的氨基酸1-509，r206h)以及与萤火虫荧光素酶报告分子(bre-luc)融合的bmp反应元件的细胞系。分离该细胞系的单克隆，将得到的细胞系命名为hek293/bre-luc/hacvr1-r206h-克隆h2。下文中称为hek293bre-luc/hacvr1-r206h。
[0278]
对于生物测定，将hek293/bre-luc/hacvr1-r206h细胞以10000个细胞/孔接种在96孔板中的测定缓冲液(dmem高葡萄糖 10％fbs pen/strep/l-谷氨酰胺)中，并在37℃和5％co2中孵育5小时。孵育5小时后，将在测定缓冲液中从300nm至73.2pm或从173.3nm至42.3pm系列稀释的抗acvr1抗体或同种型对照抗体(加上单独含有缓冲液且不含测试分子的样品)，添加到细胞中，并在25℃孵育30分钟。30分钟后，向细胞中加入3nm人激活蛋白a(hactivin a，r&d system 338-ac)、2nm人骨形态发生蛋白7(hbmp7，r&d system354-bp/c)或3nm hbmp7。为了获得配体的剂量依赖性激活，将hactivin a或hbmp7在测定缓冲液中从200nm至3.4pm或从100nm至1.7pm系列稀释(加上单独含有缓冲液且不含测试分子的样品)，并添加至未用抗体处理的细胞。在37℃和5％co2中孵育过夜后，用oneglo
tm
试剂(promega，#e6031)和victorx或envision酶标仪(perkin elmer)测量荧光素酶活性。使用prism软件(graphpad)用非线性回归(4参数逻辑)分析结果，以获得ec
50
和ic
50
值。用rlu值通过使用以下方程计算百分比抑制：
[0279][0280]
在此方程中，“rlu基线”是在无抗体的情况下以恒定量配体(hactivin a或hbmp7)处理的细胞的萤光值，“rlu抑制”是在有最大浓度的特定抗体和特定浓度的配体时的萤光值，而“rlu背景”是在无任何配体或抗体的情况下细胞的萤光值。
[0281]
测试了本发明的20种抗人acvr1抗体抑制hek293/bre-luc/hacvr1-r206h细胞激活的能力。结果如表12中所示。
[0282]
表12：抗hacvr1抗体在hacvr1配体存在下在hek293/bre-luc/hacvr1-r206h细胞中的抑制作用
[0283][0284]
如表12中所示，本发明的10种抗体显示对2nm hbmp7的至少90％抑制，抑制性抗体的ic
50
值范围为580pm至2.0nm。本发明的5种抗体显示对3nm hactivin a、2nm或3nm hbmp7的46％至78％抑制，抑制性抗体的ic
50
值范围为140pm至》100nm。本发明的5种抗体未显示对所测试的任何配体的抑制。同种型对照抗体未显示对hactivin a或hbmp7激活的hek293/bre-luc/hacvr1-r206h细胞的任何可测量的抑制。这些配体激活hek293/bre-luc/hacvr1-r206h，其中hbmp7的ec
50
值为297pm或1.22nm，hactivin a的ec
50
为333pm。
[0285]
实施例7：体内抗acvr1抗体测试；acvr1
hu/hu
小鼠血清铁调素和铁水平的分析
[0286]
在用抗acvr1抗体mab27242、mab27243、mab27247和higg4同种型对照抗体(regn1945)处理后，在acvr1
hu/hu
小鼠中测试了铁调素和铁的水平。
[0287]
bmp6介导的acvr1激活直接激活编码铁调素的基因hamp的转录。铁调素通过导致膜铁转运蛋白(slc40a1)的内化而是铁水平的负调节因子，膜铁转运蛋白是唯一已知的铁
输出蛋白。bmp6-acvr1信号传导级联的抑制导致hamp转录减少，导致循环铁调素水平降低。循环铁调素的减少导致膜铁转运蛋白水平提高，从而允许自小肠摄入增加的铁，由此增加循环铁水平。
[0288]
因此，为了确定本发明的抗acvr1抗体对血清铁调素和铁的影响，进行了小鼠体内实验。对于实验，利用表达人acvr1以替代小鼠等位基因的小鼠(称为acvr1
hu/hu
小鼠)。在实验的第1和5天，用10mg/kg的同种型对照、mab27242、mab27243或mab27247，对42只雌性acvr1
hu/hu
小鼠(12-15周龄)给药。在第8天处死小鼠，收集血清。使用hepcidin-murine complete elisa(intrinsic lifesciences,cat#hmc-001)分析血清中的铁调素蛋白水平，并使用quantichrom铁测定试剂盒(bioassay systems,cat#dife-250)分析铁水平。结果如表13中所示。
[0289]
表13：acvr1
hu/hu
小鼠的血清铁调素和血清铁水平
[0290][0291]
如表13中所示，本发明的acvr1抗体mab27242和mab27243在acvr1
hu/hu
小鼠中降低血清铁调素水平，并提高血清铁水平，而mab27247显示在acvr1
hu/hu
小鼠中对血清铁调素或血清铁水平无影响。这表明mab27242和mab27243可以抑制野生型acvr1信号传导。
[0292]
实施例8：体内抗acvr1抗体测试；创伤后异位骨化模型
[0293]
本研究评价了本发明的抗acvr1抗体mab27242和抗激活蛋白a抗体在小鼠体内创伤后ho模型中的作用。
[0294]
异位骨化(ho)是软组织中异位骨的形成，主要表现为两种形式：通常见于经历肌肉骨骼损伤或神经源性损伤的患者中的创伤后ho(tho)，以及在称为r206h的acvr1受体特定点突变下游的遗传驱动的进行性骨化纤维增生症(fop)。这两种疾病在异常骨形成中都经历了软骨内骨化过程。
[0295]
ho的主要治疗方法仍然是手术切除，手术切除常因复发而复杂化，这在fop中几乎普遍如此。虽然已证明创伤后和fop类型的ho反映了引发软骨内骨化的炎症异常，但在现有文献中，用于这种趋同程序化的在先信号似乎不同。在这两个种类中，病理学似乎依赖于对转化生长因子β(tgfβ)超家族配体敏感的特定受体子集的信号传导，包括alk2/acvr1、alk3/bmpr1a、alk4/acvr1b、alk5/tgfbri、alk6/bmpr1b和alk7/acvr1c。
[0296]
激活蛋白a见于fop成纤维细胞中。在经验证的小鼠fop模型中，激活蛋白a的隔离已经展示出可以几乎消除随后的损伤。在小鼠fop模型(acvr1[r206h])中肌肉损伤导致ho，该ho可用激活蛋白a阻断性抗体完全消除(hatsell等sci transl med.sep 2 2015；7(303):303ra137)。还已证明，通过抗激活蛋白a中和性抗体regn2477对激活蛋白a进行药理学抑制，可以有效减弱fop ho(upadhyay等,2017,j bone mineral res 32(12):2489-2499)。
[0297]
然而，最近的文献已经鉴定了tho和fop之间的差异，即，acvr1基因赋予净功能获得和通过激活蛋白a的新激活是fop损伤背后的主要驱动力。
[0298]
本实验评价了本发明的抗acvr1抗体和抗激活蛋白a抗体在小鼠体内创伤后ho模型中的作用。具体而言，在用抗acvr1抗体mab27242处理后，通过microct分析测量小鼠的创伤后异位骨化。
[0299]
重组蛋白和小鼠的抗体给药
[0300]
使用了本发明的人acvr1抗体(mab27242)和针对人激活蛋白a产生的中和性抗体(美国专利申请20150037339)。alk3-fc也用于创伤后ho形成，以研究抑制若干成骨bmp的潜在抑制作用。自行在cho细胞中产生alk3-fc并纯化。alk3-fc由与人igg1 fc结构域(d104-k330)连接的alk3胞外结构域(swiss prot#p27037 q24-r152)组成。
[0301]
在治疗研究中，分离小鼠以确保各组年龄匹配，在损伤当天开始治疗。小鼠(n＝15只/组)每周皮下(s.c.)注射25mg/kg的激活蛋白a阻断性抗体或同种型对照抗体。对于第二个实验，小鼠(n＝12只/组)s.c.注射10mg/kg的acvr1阻断性抗体、alk3-fc或同种型对照抗体。在至少13周的时期内，通过体内microct成像，监测ho形成。
[0302]
烧伤/肌腱切断损伤模型
[0303]
评估异位骨的小鼠为野生型(wt)c57bl/6j小鼠(jackson laboratories)。简言之，wt小鼠按40mg/kg腹腔注射他莫昔芬5天以启动模型。所有小鼠均接受0.06mg/kg丁丙诺啡(buprenorphine)术前镇痛48h，然后用吸入异氟烷麻醉，施用镇痛药并进行密切的术后监测。小鼠在剃光的背部接受30％总体表面积的部分厚度烧伤，然后切断左跟腱。使用水浴中加热至60℃的金属块诱导背部烧伤，并将其连续应用于背部18s。到第3周观察到ho原基，待第9周通过microct可见成熟骨形成。
[0304]
结果
[0305]
acvr1阻断性抗体或alk3-fc在小鼠创伤后ho模型中减弱ho；然而，对激活蛋白a的抑制未改变ho形成。
[0306]
在tho模型中，与诱导损伤同时开始，对小鼠施用同种型对照(n＝12)或抗acvr(n＝12)抗体或alk3 fc(n＝12)。图1a-c显示小鼠的microct分析结果，其中在诱导损伤的同时开始施用同种型对照抗体(圆圈，n＝12)、alk3-fc(正方形，n＝12)或acvr1抗体(三角形，n＝12)(mab27242)。在损伤后3、6、9和13周，通过microct分析，测量总ho(图1a)、附着ho(图1b)和非附着ho(图1c)体积。
[0307]
在烧伤/肌腱切断损伤诱导的野生型小鼠中，使用阻断性抗体抑制acvr1，使ho形成减少了40％(第13周的总ho为3.92mm3对2.4mm3)，说明负责ho形成和生长的bmp信号中的至少一些通过acvr1传递(图1a-c)。到术后9周，与同种型对照相比，acvr1阻断性抗体显著减弱总ho(图1a)和附着ho(图1b)(p《0.05)。到术后13周，与同种型对照相比，acvr1阻断性抗体显著减少非附着ho(图1c)(p《0.01)。
[0308]
在烧伤/肌腱切断损伤诱导的野生型小鼠中，alk3-fc使ho减少60％但未完全抑制(第13周的总ho为3.92mm3对1.63mm3)，这与之前公布的数据一致(agarwal等mol ther.aug 2 2017；25(8):1974-87)(图1a)。到术后6周，与同种型对照相比，alk3-fc显著减弱总ho(图1a)和附着ho(图1b)(p《0.05)。到术后13周，与同种型对照相比，alk3-fc还显著减弱非附着ho(图1c)(p《0.0001)。
[0309]
图2a-c中显示wt小鼠损伤后肢中ho体积的图像，测量为总ho体积、附着ho(由白色断线包围)或非附着ho(由白色短虚线包围)。与同种型对照(图2a)相比，alk3-fc(图2b)和acvr1抗体(图2c)处理的小鼠在13周后通过microct测量的ho体积显著减少。在alk3-fc和acvr1抗体处理组中，总ho体积和附着ho体积到损伤后6周或9周分别显著减少。
[0310]
此外，在烧伤/肌腱切断损伤模型中，与诱导损伤同时开始，对wt小鼠施用激活蛋白a(n＝15)抗体或同种型对照(n＝15)。损伤后9周，通过microct分析测量ho体积。通过总体积、附着ho体积或非附着ho体积测量的损伤后肢ho体积，在治疗组之间没有显著差异。激活蛋白a抑制未减少ho形成或生长。对漂浮的和骨结合的ho的进一步分层，也未显示出激活蛋白a处理的动物和载体对照处理的动物之间的差异(数据未显示)。
[0311]
本实施例显示，acvr1阻断性抗体在体内创伤后ho模型中显著减弱ho；然而，未观察到抗激活蛋白a抗体的显著影响。
[0312]
本发明的范围不受本文所述具体实施方案的限制。事实上，对本领域技术人员而言，除本文中所述的那些之外的本发明的多种修改将从前述描述变得显而易见。这类修改旨在落入所附权利要求书的范围之内。