一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用。


背景技术：

2.胎膜位于妊娠期宫腔的内层，在妊娠期间提供机械、免疫、内分泌和抗菌功能，可作为胎儿胎盘和母体隔室之间的屏障，在保护胎儿、传递分娩启动相关的母胎信号中发挥重要作用。胎膜结构框架由羊膜（羊膜腔的最内层）和绒毛膜（与母体蜕膜相连的胎儿组织）组成。羊膜与羊水直接接触，是羊膜腔变化的主要反应者；而绒毛膜紧邻母体蜕膜，负责维持母胎界面的免疫耐受。在正常妊娠期间，胎膜通过平衡局部可控的炎症环境使胎膜不断经历系统性重塑过程以适应胎儿生长发育和羊水生化环境变化。
3.但现有技术在分子机制水平对胎膜结构及功能的研究仍非常有限，并且在任何单细胞研究中，单细胞悬液制备的过程都是极其重要的并直接关系到后续实验是否能够顺利进行，该过程也是单细胞测序以及流式细胞分选技术首先需要解决的问题。
4.在悬浮液制备过程中，解离试剂盒必不可少，然而目前却并未发现有人胎膜组织制备单细胞悬液的解离试剂盒的报道。又由于人体各种组织器官的生物基质成分构成差异较大，因此对于解离并制备单细胞的不同组织类型需要且必须寻找到对应的解离试剂盒组分。同时，现有技术在制备悬浮液中常存在细胞死亡率高、细胞碎片多、细胞背景不干净或者损伤细胞聚集导致的结团率高等诸多问题。其影响最终的数据质量，无论是单细胞测序数据还是流式/磁性细胞分选的纯度，这极易导致科研工作者的错误解读。
5.故基于此，提出本发明技术方案。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法及应用。
7.本发明的方案是提供一种人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒，包括如下组分：酶i、酶ii、组合酶、稀释缓冲液、中和缓冲液、洗涤缓冲液和3
×
红细胞裂解缓冲液；其中：所述酶i用于提高组织穿透能力，其为中性蛋白酶；所述酶ii用于解离上皮细胞类型，其为胰蛋白酶；所述组合酶用于解离绒毛膜-蜕膜，包括iv型胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i；所述稀释缓冲液用于酶和其他缓冲液调整至最佳工作液浓度，其为d-hbss平衡盐溶液，所述d-hbss平衡盐溶液包括nacl、kcl、na2hpo4、na2hpo4·
12h2o、d-glucose和无菌去离子水；所述中和缓冲液用于抑制酶活性，包括胎牛血清和d-hbss平衡盐溶液；所述洗涤缓冲液用于洗脱细胞碎片，包括牛血清白蛋白和d-hbss平衡盐溶液；
所述3
×
红细胞裂解缓冲液用于去除残留红细胞，包括nh4cl、khco3、na2edta和无菌去离子水。其中，需要强调的是，可根据实际残留红细胞量选用稀释缓冲液配置的1~3
×
红细胞裂解缓冲液。
8.优选地，所述人胎膜组织单细胞快速解离试剂盒包括如下浓度的组分：所述中性蛋白酶为1.2~2.4 u/ml；所述胰蛋白酶为0.25~0.5wt.%；所述iv型胶原蛋白水解酶为1~3mg/ml、所述中性蛋白酶为2.4 u/ml、所述脱氧核糖核酸酶i为25μg/ml；所述nacl为0.4 mg/ml、所述kcl为8 mg/ml、所述na2hpo4为0.35 mg/ml、所述na2hpo4·
12h2o为0.06 mg/ml、所述d-glucose为1 mg/ml；所述胎牛血清为10wt.%；所述牛血清白蛋为1~4wt.%；所述nh4cl为150mm、所述khco3为10mm、所述na2edta为0.1mm。
9.基于相同的技术思路，本发明的再一方案是提供一种解离方法，所述解离方法包括如下步骤：（i）预处理：将胎膜组织转移至培养皿中去除表面残留血块，并进一步将胎膜分离为羊膜与绒毛膜-蜕膜两部分；（ii）羊膜组织的单细胞解离：（1）将羊膜组织剪碎并转移至装有酶i的ep管中，密封后将ep管转移至水浴中静置进行第一次消化；（2）将预消化后的羊膜取出并转移至装有酶ⅱ的离心管中，在水浴中静置进行第二次消化，完成后将剩余羊膜组织取出待用，并得到消化液；（3）向所述消化液中加入中和缓冲液，混匀后过滤以除去残留的微组织块，得到细胞悬液；（4）对所述细胞悬液离心除去上清液，得到细胞沉淀；向所述细胞沉淀中加入洗涤缓冲液，离心后再次收集细胞沉淀并采用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；（5）将步骤（2）取出的剩余羊膜组织转移至离心管中，并加入组合酶进行第三次消化，待消化完全后加入中和缓冲液依次进行混匀、过滤、离心，收集细胞沉淀；（6）向步骤（5）收集的细胞沉淀中加入洗涤缓冲液，混匀后离心除去上清液，再次收集细胞沉淀后采用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；（iii）绒毛膜-蜕膜组织的单细胞解离（步骤步ii同步进行）：（s1）将绒毛膜-蜕膜组织剪碎并转移至装有酶ⅰ的离心管中，并将离心管放置在水浴中孵育，完成后去除上清液再加入组合酶；（s2）将离心管再次放入至水浴中静置孵育，完成后加入酶ii混匀后继续水浴；（s3）消化完全后向离心管中加入中和缓冲液，混匀后依次过滤、离心，收集细胞沉淀；（s4）使用洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，离心后再次收集细胞沉淀并使用洗涤缓冲液重悬，完成后待用；
（iv）红细胞裂解：（ss1）将步骤（4）、步骤（6）和步骤（s4）得到的细胞悬液混合，离心后得到细胞沉淀；（ss2）采用洗涤缓冲液对细胞沉淀重悬，并加入3
×
红细胞裂解缓冲液；（ss3）裂红结束后离心收集细胞沉淀，并采用洗涤缓冲液将细胞沉淀进行清洗，去除上清液后，再次使用洗涤缓冲液重悬细胞，经过滤即得到胎膜单细胞悬液。
10.优选地，步骤（2）中，所述第一次消化的方式为：在37℃下静置消化5~15 min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。
11.优选地，步骤（2）中，所述第二次消化的方式为：在37℃下静置消化15~25 min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。
12.优选地，步骤（5）中，所述第三次消化的方式为：在37℃下静置消化20~30min，期间每5~10 min从水浴中取出并摇晃混匀。
13.基于相同的技术构思，本发明的再一方案是单细胞悬液在单细胞测序、流式/磁性细胞分选中的应用。
14.应用一：单细胞测序的单细胞悬液制备人类各种组织之间细胞的类型，状态和相互作用差异巨大。而单细胞rna测序（snrna-seq）技术提供了在单细胞水平观测基因表达的方法，可以更好地研究这些组织及其中存在的不同类型的细胞。这一技术可被用于：（1）研究一个组织中到底存在哪些种类的细胞；（2）识别未知或少见的细胞类型或状态；（3）阐明在分化过程或时间及状态变化中基因表达的改变；（4）找出在不同条件下（如加药组和疾病组）在某一特定类型的细胞中差异表达的基因；（5）探究一种细胞类型之间基因表达的变化，同时纳入空间，调控和/或蛋白质信息。
15.单细胞测序的技术流程包括：单细胞悬液制备、单细胞分离和文库构建、测序、数据分析及可视化解读。其中组织单细胞解离是从新鲜组织中制备高活性和高质量的单细胞悬液，是单细胞转录组测序（scrna-seq）的第一步，也是制约单细胞实验的顺利进行并成功获取测序数据的关键步骤。
16.应用二：流式/磁性细胞分选的单细胞悬液制备随着细胞治疗和基因治疗技术的不断发展，细胞的相关研究已经逐渐成为当前医学乃至整个生命科学领域中的研究热点，细胞培养已经成为科研中一个很重要的技术，而要获得较纯的目的细胞，流式/磁性细胞分选、纯化已成为关键的问题。这种重要技术可被用于：（1）干细胞组织工程在研究；（2）细胞增殖、活性和凋亡研究；（3）疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究；（4）基因表达和表达调控研究；（5）细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究；
（6）各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究；（7）药理药效和药物开发研究；（8）移植和细胞治疗研究；（9）生物材料对细胞结构、活性和功能的影响等。
17.流式/磁性细胞分选是把一种细胞从多细胞样品中分离出来。用抗体标记细胞，同时被用的抗体被萤光标记或连接免疫磁珠或其它，利用萤光和免疫磁珠的特性来分离细胞。其中组织单细胞解离是从新鲜组织中制备高活性和高质量的单细胞悬液，是复合类型组织细胞中通过流式细胞分选技术把单一种类细胞分选出来的第一步，也是制约细胞分选实验的顺利进行并成功获取高纯度单一类型细胞的关键步骤。
18.本发明的有益效果为：本发明提供了一种快速解离胎膜组织的技术，先将人胎膜组织通过解剖分离为羊膜和绒毛膜蜕膜两部分，再采用单一酶和组合酶相结合的方式进行同步且独立的酶解，相比其他酶解方式（对比例1~5）不仅显著提升了效率，将解离时间由6h缩短至70min，还在细胞活率、活细胞浓度和结团率上明显占优；在大大降低实验成本的同时，还提高了实验的准确性和效率。
附图说明
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1是实施例所得细胞悬液的明场图片。
21.图2是实施例所得细胞悬液的荧光场图片。
22.图3是对比例1所得细胞悬液的明场图片。
23.图4是对比例1所得细胞悬液的荧光场图片。
24.图5是对比例2所得细胞悬液的明场图片。
25.图6是对比例2所得细胞悬液的荧光场图片。
26.图7是对比例3所得细胞悬液的明场图片。
27.图8是对比例3所得细胞悬液的荧光场图片。
28.图9是对比例4所得细胞悬液的明场图片。
29.图10是对比例4所得细胞悬液的荧光场图片。
30.图11是对比例5所得细胞悬液的明场图片。
31.图12是对比例6所得细胞悬液的荧光场图片。
32.图13是实施例和对比例1~5细胞活率统计图。
33.图14是实施例和对比例1~5活细胞浓度统计图。
34.图15是实施例和对比例1~5结团率统计图。
具体实施方式
35.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行
详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
36.实施例本实施例提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，其中，所需的材料设备如表1所示，所需试剂盒的组分和浓度如表2所示。
37.表1 材料设备表2 试剂盒组分及浓度
所述解离方法包括如下步骤：（i）预处理：（1）在预冷的组织保护液中保存及运输组织；（2）新鲜娩出的胎膜组织转移到含有清洗缓冲组合液的培养皿中，在不损坏蜕膜组织的情况下小心地清除血块；（3）持手术刀取下全层组织块放入干净的培养皿中，持眼科镊将羊膜与绒毛膜-蜕膜组织分离，并分别转移到干净的培养皿中，进行下一步操作。
38.（ii）羊膜组织的单细胞解离：（s1）持眼科剪将羊膜组织剪碎；（s2）剪碎的组织转移到装有酶i的1.5mlep管中，用封口膜密封ep管；（s3）将ep管放入水浴中，并在37℃下静置消化10min，每5min从水浴中取出并用手轻轻摇晃，消化完成后，持眼科镊将羊膜捞出，并放入装有1ml酶ii的离心管中，通过摇晃离心管重新悬浮组织颗粒，在37℃下静置20min，期间每5min从水浴中取出并用手轻轻摇晃，完成后将羊膜组织取出待用，并得到消化液；（s4）向所述消化液中加入预冷的中和缓冲液，吹打混匀后，通过细胞筛过滤，去除结团细胞及组织块；（s5）过滤后的细胞悬液在离心机中离心5min后，除去上清液；（s6）向细胞沉淀中加入预冷的洗涤缓冲液，吹打混匀后，细胞悬液在离心机中离心5min，收集后使用预冷的洗涤缓冲液重悬，冰上放置，待用；
（s7）持眼科镊将步骤（3）的羊膜组织捞出并转移至干净的离心管中，并向其中加入组合酶，37℃下继续消化30min，期间每5min从水浴中取出并用手轻轻摇晃；（s8）待消化完全后，向离心管中加入预冷的中和缓冲液，吹打混匀；通过细胞筛过滤，在离心机内离心5min收集细胞；（s9）去除上清液，使用预冷的洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，细胞悬液在离心机内离心5min，收集细胞沉淀并使用再次预冷的洗涤缓冲液重悬，冰上放置，待用。
39.（iii）绒毛膜-蜕膜组织的单细胞解离：（ss1）持眼科剪将绒毛膜-蜕膜组织剪碎；（ss2）将组织转移到含有酶i的离心管中，37℃静置孵育10min，期间每5min从水浴中取出并用手轻轻摇晃；（ss3）孵育后，去除上清液，并向其中加入组合酶；（ss4）将离心管转移至37℃水浴锅中，静置孵育30min，期间每5min从水浴中取出并用手轻轻摇晃；（ss5）向离心管中加入酶ii，吹打混匀后继续水浴20min；（ss6）消化完全后，向离心管中加入预冷的中和缓冲液，吹打混匀；并通过细胞筛过滤，在离心机内离心5min收集细胞；（ss7）去除上清液，使用预冷的洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，细胞悬液在离心机内离心5min，收集细胞沉淀并使用洗涤缓冲液重悬。
40.（iv）红细胞裂解：（sss1）将步骤（s6）、步骤（s9）、步骤（ss7）得到的细胞混匀，在离心机内离心5min；获得的细胞沉淀用预冷的洗涤缓冲液重悬，并缓慢加入3
×
红细胞裂解缓冲液（若红细胞量较少，可使用稀释缓冲液将红细胞裂解缓冲液稀释至1
×
后再进行使用），置于冰上5min裂解红细胞；（sss2）裂红结束后，于离心机内离心5min收集细胞，并用洗涤缓冲液将细胞沉淀清洗一遍；（sss3）去除上清液后，使用洗涤缓冲液重悬细胞，经细胞筛过滤后即得到胎膜总单细胞悬液。
41.最后采用ao/pi染料染色并计数。使用细胞计数仪对所获得的细胞悬液进行质控，结果显示：活细胞浓度为184万/ml；由图1可看出明场图片表明背景干净，细胞碎片及残留红细胞数少，细胞形态类型丰富；由图2可看出荧光场可见细胞活率为92.9%，结团率为3.9%（以ao/pi计数为标准）。同时也需说明，尽量选取新鲜的胎膜-蜕膜样品进行操作，胎膜-蜕膜离体时间长，细胞容易死亡，影响最终的实验效果。
42.需要强调的是，发明人结合胎膜的病理生理学技术，考虑到胎膜是一种富含胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白聚糖等复杂基质成分且同时存在多种类型细胞的相对致密组织，采用胰蛋白酶、中性蛋白酶和胶原酶结合的复合酶解方法是最优解决方案。
43.其中，胰蛋白酶存在于多数脊椎动物的消化系统中，具有水解消化蛋白质的功能，对于组织和细胞来说，胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解，从而达到是细胞分散的作用，考虑到不同组织或细胞对胰蛋白酶的作用、反应和耐受不同，使用胰蛋白酶进行解离时的条件即浓度、时间和温度具有较高要求，以防止消化过度造成细胞损伤；同时如果消化
时间过短亦难以充分破坏细胞间连接导致细胞分散不充分进而出现结团率高的情况。
44.胶原酶也称胶原蛋白水解酶，其可特异性的水解胶原蛋白肽键，且不造成其他类型组织蛋白，所以特别适用于富含胶原的如皮肤、结直肠等组织类型，胎膜亦是如此；考虑到实际上胶原酶具有6种分型，即胶原酶ⅰ、胶原酶ⅱ、胶原酶ⅲ、胶原酶ⅳ、胶原酶
ⅴ
、胶原酶ⅵ，而胎膜组织主要为ⅵ型胶原蛋白，因此可以选用ⅳ型胶原酶进行组织解离。
45.中性蛋白酶是一种内切酶，在适合的温度和ph条件下，其可将大分子蛋白质水解为氨基酸，适用于多种动物蛋白水解，消化终止需要含胎牛血清的平衡盐溶液配合进行。
46.因此发明人建立了一种基于胎膜组织特异性、分布解离和时间依赖的复合酶与单一酶相结合的温和解离方案，为获取胎膜单细胞悬液同时充分保障细胞活力提供了可靠保障。
47.对比例1对比例1提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，与实施例的区别在于，本对比例仅采用中性蛋白酶（单一酶）进行酶解。最后采用ao/pi染料染色并计数，明场图片如图3所示，荧光场图片如图4所示。
48.由于中性蛋白酶作用部位在基底膜iv型胶原和纤维粘连蛋白，仅局限于通过破坏半桥粒使组织疏松，提高组织穿透能力，因此消化后获得细胞数很少。此理论分析与图片所表现出的结果保持一致。
49.对比例2对比例2提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，与实施例的区别在于，本对比例仅采用胰蛋白酶（单一酶）进行酶解。最后采用ao/pi染料染色并计数，明场图片如图5所示，荧光场图片如图6所示。
50.由于胰蛋白酶主要作用于上皮类型细胞表面黏附的连接蛋白，但由于胎膜组织外层具有大量胶原覆盖，胰蛋白酶不能有效穿透组织，同时不能消化胶原层内的间质类型细胞，因此消化后仅获得少量上皮类型细胞，且长时间消化易导致大量细胞死亡。此理论分析与图片所表现出的结果保持一致。
51.对比例3对比例3提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，与实施例的区别在于，本对比例仅采用ⅳ型胶原酶（单一酶）进行酶解。最后采用ao/pi染料染色并计数，明场图片如图7所示，荧光场图片如图8所示。
52.由于ⅳ型胶原酶主要作用于富含胶原的间质类型细胞，而上皮细胞类型对ⅳ型胶原酶不敏感，因此采用该单一酶消化后仅获得少量间质类型细胞。此理论分析与图片所表现出的结果保持一致。
53.另外，需要强调的是，由于脱氧核糖核酸酶仅作用于因细胞解离导致的游离dna，以减少因dna缠绕导致的细胞死亡，因此并不能单独作为单细胞解离的主体使用。
54.对比例4对比例4提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，与实施例的区别在于，本对比例仅采用ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶组成的组合酶进行酶解。最后采用ao/pi染料染色并计数，明场图片如图9所示，荧光场图片如图10所示。
55.由于缺少解离上皮类型细胞的胰蛋白酶，因此采用该组合酶消化后仅获得大量间
质类型细胞，获得的上皮类型细胞数较少。此理论分析与图片所表现出的结果保持一致。
56.对比例5对比例5提供一种人胎膜组织单细胞的解离方法，与实施例的区别在于，本对比例采用中性蛋白酶作为单一酶，采用ⅳ型胶原酶和胰蛋白酶作为组合酶，以组合酶与单一酶同时加入的方式进行酶解。最后采用ao/pi染料染色并计数，明场图片如图11所示，荧光场图片如图12所示。
57.将单一酶即胰蛋白酶与组合酶即ⅳ型胶原酶和中性蛋白酶同时加入进行单细胞解离，一方面，伴随着长时间组合酶解离，易导致由于长时间胰蛋白酶作用引起上皮类型细胞死亡，另一方面，如果依据胰蛋白酶解离时间，则易导致间质类型细胞解离不充分。此理论分析与图片所表现出的结果保持一致。
58.对实施例、对比例1~5的细胞活率、活细胞浓度和结团率进行统计，结果分别如图13、图14、图15所示。由图13~图15可知，仅使用单一酶会导致某些细胞解离不充分，最终所获得的细胞悬液活细胞浓度低，细胞种类单一，结团率高，细胞比例不符合组织中真实比例，同时加入所有种类的蛋白酶处理细胞，细胞活率大大降低，同时结团率也处于较高水平。
59.同时需要指出，本发明从众多酶类中选出中性蛋白酶、iv型胶原蛋白水解酶、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i这四种酶，相比于其他公开的发明专利酶类组合更加符合胎膜的组织学特征，筛选优化的混合酶种类及浓度更具有针对性和高效性。这为业内公认的较难解离的含胶原较多且内含细胞种类多的组织类型获取单细胞提供了良好的工具，也是首次开发出能够成功解离胎膜并符合单细胞测序条件的技术方法。
60.本发明的单一酶与组合酶相结合的酶解方法，是考虑到胎膜组织结构和细胞解剖分布后做出的创新。在优化出最适配比和消化时间等条件后（如实施例所述），特别是优化的酶浓度配比较其他公开的发明专利酶类组合更加符合胎膜的组织学特征。得到比较符合单细胞测序上机标准的细胞悬液，相对于同类产品中仅使用单一酶类方法提高了不同类型细胞的获取数量，使得获取的单细胞悬液中组织细胞构成完整性更高；同时，仅在关键步骤中使用组合酶形式，相比广谱同时使用多种胶原酶的方法更节约成本和时间，更重要的是有效减少了传统混合酶法处理不耐受类型细胞因过度消化造成的细胞死亡。
61.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。