一种逆转录酶的稳定剂的制作方法

1.本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种新的逆转录酶的稳定剂。


背景技术：

2.1970年temin等在致癌rna病毒中发现了逆转录酶，并认为此酶与病毒的致癌性质有关。后来发现逆转录酶不仅普遍存在于rna病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有逆转录酶。逆转录酶的发现表明遗传信息可以从rna传递到dna。它促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，已成为这些学科研究的有力工具。
3.逆转录酶主要包括以下三种活性：
①
逆转录活性：以rna为模板，催化dntp聚合，生成dna-rna杂合双链。
②
rnase h活性：水解杂合双链中的rna，得到与rna互补的dna单链（cdna）。
③
dna指导的dna聚合酶活性：以cdna单链为模板，以dntp为底物，再合成双链dna。
4.目前通过深入研究的逆转录酶包含:人类免疫缺陷病毒1型的逆转录（pdb：1hmv）；莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶（mmlv）；禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶（amv）；维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶。其中mmlv和amv是分子pcr检测常用的两种逆转录酶，尤其是mmlv最为常见，它一种重组dna聚合酶，可以从单链rna、dna或rna:dna杂交中合成互补的dna链。与amv 相比，mmlv缺乏dna内切酶活性，rnase h活性较低。
5.近年来，随着分子生物学的发展和科学领域的不断扩充，逆转录酶有了更明显的需求。由于逆转录酶的保存条件比较严格，酶的保存温度一般在0℃-4℃，零度以下溶质的冰晶化可引起盐分浓缩，导致溶液的ph值发生改变，从而可能引起酶巯基间连接成为二巯键，损坏酶的活性中心，并使酶变性。因此保存和运输逆转录酶就成为人们更加关注的问题。
6.现有技术中有研究通过bsa乙酰化对逆转录酶的改造，经过改造后，逆转录酶的反应温度虽然可以提高，但其半衰期仍然较短，且其热稳定性还是无法满足使用的要求。因此需要寻找一种新的逆转录酶的处理方法来解决上述问题。


技术实现要素：

7.本发明的一个方面，是针对现有技术中逆转录酶的热稳定性差的缺点，提供了一种逆转录酶的稳定剂。
8.本发明提供的技术方案为：一种逆转录酶的稳定剂，所述稳定剂中包含乙酰化牛血清白蛋白和选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质。
9.在本发明中，发明人发现，通过乙酰化牛血清白蛋白、选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质与逆转录酶的相互作用，可以使逆转录酶在常温下结构更加稳定，保持良好的生物活性。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述单糖为选自葡萄糖、核糖、果糖、脱氧核糖或半乳糖中的一种或几种，所述双糖为选自麦芽糖、乳糖或蔗糖中的一种或几种。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述单糖为葡聚糖、核糖或脱氧核糖。
10.在本发明中，所述乙酰化牛血清白蛋白与所述选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质可以以任意合适的比例混合。但为了达到更好的效果，在本发明的某些实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白与所述选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质的质量比为10：1～100：1。
11.在本发明中，所述乙酰化牛血清白蛋白可以为固体或液体的形式。当所述乙酰化牛血清白蛋白为固体粉末时，在使用中可通过合适的溶剂溶解。作为优选，所述溶剂为水。更优选地，在本发明的一个事实方式中，所述溶剂为不含核酸酶的水。
12.为了获得更好的效果，在本发明的某些实施方式中，所述逆转录酶的稳定剂还可以包含，例如，但不限于，缓冲液、rna酶抑制剂、dna酶抑制剂、防腐剂、色素、助溶剂、引物、终止剂，等。
13.本发明的另一个方面，是提供了一种逆转录酶的处理方法，将逆转录酶与乙酰化牛血清白蛋白和所述选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质按照10：1～100：1的质量比混合并混匀。上述混合可以通过反复颠倒实现充分混匀，也可以通过涡旋振荡实现充分混匀。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白先与所述选自单糖、双糖或atp中的一种或几种物质混合并混匀后再加入所述逆转录酶混匀。
14.优选地，所述逆转录酶为人类免疫缺陷病毒1型的逆转录酶（pdb：1hmv）、莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶（mmlv）、禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶（amv）或维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶。
15.在本发明中，所述乙酰化牛血清白蛋白可以通过购买市售商品获得，也可以通过合适的方法进行制备。在本发明的某些实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白的制备方法为：将牛血清白蛋白溶液在碱性环境下与乙酰化试剂进行反应，产物经干燥粉碎后得到所述乙酰化牛血清白蛋白的粉末。
16.对蛋白质进行的乙酰化反应是指将供体的乙酰基转移到受体蛋白的末端氨基酸残基（α氨基）或者链中的赖氨酸残基（ε氨基）上的反应。上述反应可以在碱性环境下进行。为了获得更好的效果，所述碱性环境可以为ph值8.0～8.5，利用碱性试剂调节所述ph值。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述碱性试剂为碳酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、磷酸钠、次氯酸钠、碳酸氢铵或碳酸钙。更优选地，在本发明的某些实施方式中，所述碱性试剂为碳酸钠、碳酸氢钠或亚硫酸钠。
17.常用的乙酰化试剂包括羧酸酰化剂、羧酸酯酰化剂、酸酐酰化剂和酰氯酰化剂。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述乙酰化试剂为乙酰氯、乙酸酐、冰醋酸、n-甲氧基二乙酰胺或三氟乙酰三氟甲磺酸酯。更优选地，在本发明的某些实施方式中，所述乙酰化试剂为乙酰氯、乙酸酐或冰醋酸。
18.在本发明中，发明人还研究了不同乙酰化试剂的添加量对牛血清白蛋白乙酰化程度以及对本发明中逆转录酶稳定剂效果的影响。发明人创造性地发现，随着乙酰化试剂用量的增加，乙酰化程度的提高，乙酰化牛血清白蛋白的功能性综合评价值先快速增加，而后缓慢下降。因此，为了获得更好的效果，在本发明的某些实施方式中，当所述乙酰化试剂为乙酸酐时，所述乙酸酐的添加量为所述牛血清白蛋白质量的5%～10%；当所述乙酰化试剂为乙酰氯时，所述乙酰氯的添加量为所述牛血清白蛋白质量的2%～7%；当所述乙酰化试剂为冰醋酸时，所述冰醋酸的添加量为所述牛血清白蛋白质量的5%～13%。
19.在本发明中，上述乙酰化反应的反应温度可以为-10℃～100 ℃。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述乙酰化反应的反应温度可以为0℃～40 ℃。
20.在本发明的某些实施方式中，所获得的乙酰化牛血清白蛋白可以为溶液状态，也可以为固体粉末状态。
21.本发明的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括逆转录酶和上述稳定剂。除此之外，在本发明的某些实施方式中，所述试剂盒还可以包含一种或多种核苷酸、一种或多种dna聚合酶、一种或多种缓冲液、一种或多种引物、或一种或多种终止剂。在本发明的某些实施方式中，所述试剂盒还可以包含裂解液。
22.本发明的另一个各方面，是提供了一种上述逆转录酶的稳定剂或上述试剂盒在制备新型冠状病毒（covid-19）检测产品中的用途。
23.本发明的有益效果为：本发明逆转录酶的稳定剂能够使逆转录酶在常温下结构更加稳定，保持良好的生物活性，仓储成本低，能够满足在常温下逆转录酶的运输，大大降低了逆转录酶在运输方面的风险成本。
附图说明
24.图1为本发明实施例中-20℃下存放的mmlv酶进行新型冠状病毒（2019-ncov）核酸检测的灵敏度测试曲线图，其中，阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性质控品检测荧光曲线最高点；图2为本发明实施例中在常温下存放的mmlv酶进行新型冠状病毒（2019-ncov）核酸检测的灵敏度测试曲线图；图3为本发明实施例中在常温下存放两周后的mmlv酶进行新型冠状病毒（2019-ncov）核酸检测的灵敏度测试曲线图；图4a、图4b和图4c不同用量的乙酰化试剂对乙酰化bsa的功能性综合评价值影响的结果图，其中图4a中的乙酰化试剂为乙酸酐，图4b中的乙酰化试剂为乙酰氯，图4c中的乙酰化试剂为冰醋酸。
具体实施方式
25.本发明公开了一种逆转录酶的稳定剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
27.下面就本发明中出现的部分术语作以解释。
28.术语“稳定剂”是指当生产、单独放置或保存材料时添加以防止状态变化或化学变
化的材料。酶稳定性是储存后保持酶活性的能力。这可以通过测量储存前后的酶活性以确定失去了多少活性来确定。出于实际目的，可以通过比较储存样品和冷冻参考样品的活性来确定残余活性，将这两种样品同时分析，以消除分析的日常变化。
29.术语“乙酰化牛血清白蛋白”（bsa）是牛血清中的一种球蛋白, bsa一般作为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入bsa后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 bsa后能使其活性大幅度提高。不需要加bsa的酶加入bsa一般不会受到什么影响。对多数底物dna而言，bsa可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，bsa可以使酶更加稳定，因为在不含bsa的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10-20min甚至更短的时间。而bsa可以结合缓冲液或底物dna中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。因此bsa的用途极其广泛，比如用于生化研究、遗传工程和医药研究；用作医药保健食品、调味品；维持渗透压、ph缓冲、载体作用；在pcr体系中有助于taq酶的稳定性及活性，可以提高pcr的效率。bsa含有 581 个氨基酸残基，其中含有 35 个半胱氨酸组成了 17 个二硫键，在肽链的第 34 位有一个自由巯基。这些特点使得bsa 可与多种阳离子、阴离子和其它小分子物质结合。在血液中血清蛋白起着维持渗透压作用、ph 缓冲作用、载体作用等等，正是由于血清蛋白本身就是生物体内的一种物质，因此由bsa制备的水凝胶也有着良好的生物相容性，在作为逆转录酶载体有着良好的生理和机械保护作用。
30.术语“逆转录”是指在生物学中以rna为模板合成dna的过程，即rna指导下的dna合成。此过程中，核酸合成与转录（dna到rna）过程与遗传信息的流动方向（rna到dna）相反，故称为逆转录。逆转录过程是rna病毒的复制形式之一，在逆转录的过程中需要逆转录酶的催化。故而逆转录酶在rna逆转录的过程中起着不可或缺的作用。逆转录在分子生物领域已有很广泛的应用，比如逆转录，主要是提取组织或细胞中的总rna，以rna为模板，利用逆转录酶反转录成cdna，再以cdna链为模板进行pcr扩增，从而获得大量拷贝。逆转录pcr的出现使rna检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量rna样品分析成为可能。这在体外诊断领域大大提高了疾病的检测诊断效率。
31.术语“蛋白质乙酰化”是指把乙酰coa的乙酰基团转移至蛋白质赖氨酸残基上，组蛋白和其他蛋白均可发生乙酰化修饰。组蛋白乙酰化是一个动态可逆的过程，由组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，hat）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，hdac）调节。hats催化乙酰基团与赖氨酸共价连接，中和组蛋白的正电荷，减弱其与dna的静电相互作用，从而使染色质处于开放状态，有利于转录因子和rna聚合酶与dna特定序列结合，激活基因转录；反之，hdacs催化去除乙酰基，使染色体结构紧密，从而抑制基因转录。在哺乳动物中，hats 主要包括gnat 家族、cbp/p300 家族和myst 家族; hdacs 分为zn
2
依赖性hdac（histone deacetylase）家族和nad

依赖性sirtuin（sirt）家族，前者包括ⅰ型（hdac1/2/3/8）、ⅱa 型（hdac4/5/7/9）、ⅱb 型（hdac6/10）、ⅳ型（hdac11），后者包括sirt1
‑ꢀ
7 蛋白，又称ⅲ型hdacs。组蛋白乙酰化是重要的表观调控机制之一，细胞通过维持组蛋白乙酰化状态来上调基因转录活性，进而激活糖、脂代谢基因表达。除组蛋白外，其他蛋白也能进行乙酰化修饰。乙酰化既能调节代谢有关转录因子，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，pgc-1α），还能特异性调节糖酵解、糖异生、三羧酸循环和脂
肪酸氧化等能量代谢途径中的多种酶类，进而对细胞代谢活动进行调控。此外，hats和hdacs还可改变代谢相关信号通路，如胰岛素信号通路、自噬相关通路，进而调节营养物质的感受和细胞自噬。总之，蛋白乙酰化可调节细胞内葡萄糖、脂质、氨基酸的代谢活动并维持代谢稳态，故调控蛋白乙酰化水平对治疗代谢型疾病具有重要意义。
32.术语“多糖”是指由通过糖苷键连接在一起的单糖单元的长链构成的分子。多糖的结构可以是直链到强支化的。例子包括储存多糖，诸如淀粉和糖原；以及结构多糖，诸如纤维素和甲壳素。多糖包括天然多糖或通过交联、氧化、乙酰化、部分水解等化学修饰的多糖。
33.术语“常温”是指在没有升温或冷却的情况下的自然温度，其可以意指例如约10℃至30℃的范围内的任一温度或者约25℃或23℃左右的温度。
34.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
35.实施例1：bsa蛋白质的乙酰化：称取一定量bsa（10g）溶于定量的水中，用1mol/l naoh调ph值（8.0），磁力搅拌或电动搅拌，分批加入乙酸酐，反应过程中用2mol/l naoh调节ph值（8.0），离心（3000r/min，10 min），鼓风干燥（45℃），粉碎，保存。
36.bsa酰化程度的测定：茚三酮法moore and stein。酰化度用吸光度值反映，吸光度值越大，说明酰化程度越小，适当调整用量以确保bsa完全乙酰化。
37.其它反应条件固定为：反应温度20℃，酰化试剂用量为bsa质量的10%。
38.取上一步得到的乙酰化粉末1g，加入10ml的葡聚糖涡旋振荡或充分颠倒以保证混匀，得到逆转录酶稳定剂，再加入适量的逆转录酶充分涡旋振荡即可得到逆转录混合酶。
39.随着乙酸酐用量的增加，乙酰化程度的提高，乙酰化bsa的功能性综合评价值先快速增加，而后缓慢下降（当乙酸酐的添加量在5%-10%之间时，产物的功能性综合评价值较高）。
40.实施例2：bsa蛋白质的乙酰化：称取一定量bsa（10g）溶于定量的水中，用1mol/l na2co3调ph值（8.0-8.5），磁力搅拌或电动搅拌，分批加入乙酰氯，反应过程中用2mol/l na2co3调节ph值（8.0-8.5），离心（3000r/min，10 min）,鼓风干燥（45℃），粉碎，保存。
41.bsa酰化程度的测定：茚三酮法moore and stein。酰化度用吸光度值反映，吸光度值越大，说明酰化程度越小，适当调整用量以确保bsa完全乙酰化。
42.其它反应条件固定为：反应温度10℃，酰化试剂用量为bsa的18%。
43.取上一步得到的乙酰化粉末1g,加入10ml的脱氧核糖涡旋振荡或充分颠倒以保证混匀，得到逆转录酶稳定剂，再加入适量的逆转录酶充分涡旋振荡即可得到逆转录混合酶。
44.随着乙酰氯用量的增加，乙酰化程度的提高，乙酰化bsa的功能性综合评价值先快速增加，而后缓慢下降（当乙酰氯的添加量在2%-7%之间时，产物的功能性综合评价值较高）。
45.实施例3：bsa蛋白质的乙酰化：称取一定量bsa（10g）溶于定量的水中，用1mol/l koh调ph值（8.0-8.5），磁力搅拌或电动搅拌，分批加入冰醋酸，反应过程中用2mol/l koh调节ph值（8.0-8.5），离心（3000r/min，10 min）,鼓风干燥（45℃），粉碎，保存。
广东菲鹏生物有限公司）。本实验例中使用的核酸检测试剂盒为来自北京纳捷诊断试剂有限公司的新型冠状病毒核酸检测试剂盒（《新型冠状病毒（2019-ncov）核酸检测试剂盒（荧光pcr法）》）。
54.本实验例中采用的rt-qpcr的体系如表1所示。
55.表1反应体系（30μl）实验结果：对照组结果如表2和图1所示，rt酶保存在-20℃的环境下，ct值均在38以下，说明该种实验验证方法有效，且rt酶保持了较好的活性。
56.表2-20℃下存放的mmlv酶进行新型冠状病毒核酸检测灵敏度测试结果当用本发明实施例1的稳定剂来处理rt酶时，将其在常温下存放并进行新型冠状病毒（2019-ncov）核酸检测灵敏度测试时，ct值仍能控制在有效范围内。结果如表3和图2所示。
57.表3常温下存放的mmlv酶进行新型冠状病毒核酸检测灵敏度测试结果
为了进一步验证该制备方法等否满足在常温下运输，将处理过的逆转录混合酶在实验室常温下放置两周再次进行核酸检测灵敏度测试，结果显示，混合酶仍能保持良好的灵敏度，进而说明该方法合成的逆转录混合酶提高了逆转录酶在常温下的热稳定性，为逆转录酶的室温下长距离运输提供了可能。结果如表4和图3所示。
58.表4常温下存放两周后的mmlv酶进行新型冠状病毒核酸检测灵敏度测试结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。