一种检测人组胺受体HRH4mRNA表达水平的试剂、试剂盒和应用的制作方法

一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂、试剂盒和应用。


背景技术：

2.组织胺(histamine)是一种活性胺化合物，是广泛存在于动植物体内的一种生物胺，是由组氨酸脱羧而形成的，通常贮存于组织的肥大细胞中，是身体内的一种重要的化学传导物质，可以影响许多细胞的反应，包括过敏、炎性反应、胃酸分泌等，当机体受到某种刺激引发抗原
‑
抗体反应时，引起肥大细胞的细胞膜通透性改变，释放出组胺，与组胺受体作用产生病理生理效应。组胺合成过程主要发生在肥大细胞、嗜碱性粒细胞、肺部、皮肤和胃肠粘膜中，和储存组胺的组织相一致。组胺与其他递质一样，先和靶细胞上特异性受体结合，从而改变细胞的生物活性，并发挥广泛的生理或病理作用。组胺的炎症作用，即组胺对体内的免疫动态平衡的影响依赖于现行已知的4个组胺受体的表达和活性。这4个组胺受体按被发现顺序命名为：组胺1型受体(h1)、组胺2型受体(h2)、组胺3型受体(h3)、组胺4型受体(h4)，其中，h4受体优势分布于免疫系统或造血相关的组织或细胞，在骨髓、外周造血细胞等与炎症反应相关的部位高度表达。因此h4受体在免疫性疾病如过敏反应、哮喘等中成为新的治疗靶位。h4受体参与肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞的趋化作用以及t细胞、树突状细胞的细胞因子的产生，参与炎性反应。
3.大部分过敏性疾病患者的治疗方式都是医生凭经验采用对症治疗，用抗组胺药来减轻过敏症状。以h1受体为靶标的抗组胺药对于一些过敏性患者有效，但也有局限性。h4受体拮抗剂的应用则可对部分h1受体拮抗剂无效的患者起到良好的治疗效果。但用抗组胺治疗并非对所有患者有效，也无法量化治疗效果，长期服药还会产生一系列的副作用，但是目前没有相关的研究和记载。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂、试剂盒和应用，可利用rna一步检测人组胺受体hrh4 mrna的表达水平，为该蛋白的检出提供准确度高、检测范围广及灵敏度高的检测手段。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂，所述试剂包括人组胺受体hrh4的特异性引物和探针，所述特异性引物包括hrh4
‑
f和hrh4
‑
r，所述探针包括h4
‑
probe；
7.所述hrh4
‑
f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述hrh4
‑
r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述h4
‑
probe的核苷酸序列如seq id no.3所示。
8.优选的，所述试剂还包括内参基因gapdh的特异性引物和探针，所述内参基因
gapdh的特异性引物包括gapdh
‑
f和gapdh
‑
r，所述探针包括g
‑
probe；
9.所述gapdh
‑
f的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述gapdh
‑
r的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述g
‑
probe的核苷酸序列如seq id no.6所示。
10.优选的，在所述h4
‑
probe和g
‑
probe的5’端分别标记不同的荧光报告基团，3’端标记标记相同或不同的淬灭基团。
11.优选的，所述荧光报告基团包括fam和joe，所述淬灭基团包括bhq1。
12.优选的，所述试剂中，hrh4
‑
f、hrh4
‑
r、h4
‑
probe、gapdh
‑
f、gapdh
‑
r和g
‑
probe的浓度分别为2.25nm、1.5nm、1.5nm、1nm、1nm、1.5nm。
13.本发明还提供了一种一步法检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂，pcr反应液、酶混合液、rox参比染料和无核酶水。
14.优选的，所述pcr反应液包括dntp mix、mgcl2和缓冲液；
15.所述酶混合液包括taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和taq酶抗体；所述taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和taq酶抗体的质量比为15:5:4:1。
16.优选的，所述试剂盒还包括人组胺受体hrh4的rna标准品。
17.本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在制备免疫性疾病治疗用药依据或动态监测治疗效果的工具中的应用。
18.优选的，利用所述试剂或所述试剂盒配制反应体系，并进行qrt
‑
pcr反应；
19.所述反应体系以20μl计，包括：无核酶水2.4μl，pcr反应液10μl，酶混合液0.5μl，rox参比染料0.5μl，所述试剂2μl和标准品或rna 5μl；
20.所述qrt
‑
pcr反应的程序包括：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环。
21.本发明提供了一种检测人组胺受体hrh4(hrh4)mrna表达水平的试剂，并基于该试剂制备了一步法检测hrh4 mrna表达水平的试剂盒，利用所述试剂或试剂盒，可一步法定量检测人血液、鼻腔分泌物、支气管冲洗液、唾液、泪液样本中hrh4 mrna的表达水平，操作方法简单，检测时间较短，为h4抗组胺药提供了可指导用药及准确量化疗效的试剂盒产品。
22.本发明所述试剂或试剂盒，采用一步法检测，无需单独进行反转录操作，极大降低了造成气溶胶污染的风险；与免疫学检测方法相比，本发明所对应的检测方法检测的灵敏度高，灵敏度高，可以检测低浓度的临床样本，能够灵敏地探测到hrh4的含量变化，检测范围可跨越至少6个数量级，增加了检测结果的准确性，能在1小时之内完成至少80人份检测，从而更早期、更准确、更快速地对治疗效果进行动态监测和疗效评估。
附图说明
23.图1为hrh4 mrna taqman实时荧光定量rt
‑
pcr标准曲线；
24.图2为精密度检测结果图，其中1：1.0
×
107copies/μl，2：1.0
×
104copies/μl；
25.图3为准确度检测结果图；
26.图4为灵敏度检测结果图；
27.图5为临床样本检测结果图，其中1：病例3治疗前gapdh mrna；2：病例3治疗后gapdh mrna；3：病例3治疗前hrh4 mrna；4：病例3治疗后hrh4 mrna；
28.图6为在非最佳引物、探针设计的情况下，低值精密度扩增曲线图；
29.图7为酶混合液对扩增效果的影响；
30.图8为pgm
‑
t的载体质粒结构图。
具体实施方式
31.本发明提供了一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂，所述试剂包括人组胺受体hrh4的特异性引物和探针，所述特异性引物包括hrh4
‑
f和hrh4
‑
r，所述探针包括h4
‑
probe；
32.所述hrh4
‑
f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述hrh4
‑
r的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述h4
‑
probe的核苷酸序列如seq id no.3所示。
33.本发明所述试剂优选还包括内参基因gapdh的特异性引物和探针，所述内参基因gapdh的特异性引物优选包括gapdh
‑
f和gapdh
‑
r，所述探针优选包括g
‑
probe；所述gapdh
‑
f的核苷酸序列优选如seq id no.4所示，所述gapdh
‑
r的核苷酸序列优选如seq id no.5所示，所述g
‑
probe的核苷酸序列优选如seq id no.6所示。在本发明中，优选在所述h4
‑
probe和g
‑
probe的5’端分别标记不同的荧光报告基团，3’端标记标记相同或不同的淬灭基团。本发明实施例中，选用的荧光报告基团优选包括fam和joe，所述淬灭基团包括bhq1，并委托上海桑尼生物科技有限公司合成具体的特异性引物和探针(表1)。
34.表1 taqman实时荧光定量pcr引物探针
[0035][0036]
在本发明所述试剂中，hrh4
‑
f、hrh4
‑
r、h4
‑
probe、gapdh
‑
f、gapdh
‑
r和g
‑
probe的浓度或摩尔数分别为2.25nm、1.5nm、1.5nm、1nm、1nm、1.5nm。
[0037]
本发明还提供了一种一步法检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂，pcr反应液、酶混合液、rox参比染料和无核酶水。
[0038]
本发明所述pcr反应液优选包括dntp mix、mgcl2和缓冲液；所述dntp mix优选为datp、dttp、dctp、dgtp的混合物，购自thermofisher公司(货号：r0192)，工作浓度优选为0.1～1mm；mgcl2的使用浓度优选为5～20mm；缓冲液为10～50mm tris
‑
hcl缓冲液(ph 8.0)。
[0039]
所述酶混合液包括taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和taq酶抗体，且所述taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和taq酶抗体的质量比优选为15:5:4:1。使用该比例可以得到最佳的扩增效果。
[0040]
本发明所述试剂盒优选还包括人组胺受体hrh4的rna标准品，用以配制标准曲线。
[0041]
在本发明中，在应用所述试剂盒进行检测时，以rna为模板直接进行taqman实时荧光定量pcr，无需单独进行反转录过程；taq酶为耐热的taq dna聚合酶，利用其3
′→5′
聚合酶活性以dna为模板，将dntp中的脱氧单核苷酸逐个加到3
‑
oh末端；同时利用其5
′→3′
外切酶活性即能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关，又可以从5’端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸，由此在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的探针切断；逆转录酶可将mrna逆转录成cdna以进行pcr反应；rna酶抑制剂用来抑制外源性rnase的活性；taq酶抗体是热启动pcr用抗taq抗体，其与taq酶结合后抑制dna聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，taq酶抗体在pcr反应最初的dna变性步骤中变性，taq酶恢复活性，实现pcr扩增。
[0042]
本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在制备免疫性疾病治疗用药依据或动态监测治疗效果的工具中的应用。
[0043]
在本发明中，所述免疫性疾病优选包括过敏性疾病，利用本发明所述试剂或试剂盒检测组胺h4受体(hrh4)mrna的表达量，一方面可以判断患者的过敏症状是否由通过组胺活化h4受体途径引起(非组胺途径引起的过敏症状不表达组胺受体)和指导用药量(h4受体表达量高的需要更高剂量的h4受体拮抗剂)，另一方面可以动态监测h4受体拮抗剂治疗的效果。
[0044]
本发明在应用所述试剂或试剂盒时，优选利用所述试剂或所述试剂盒配制反应体系，并进行qrt
‑
pcr反应；所述反应体系以20μl计，优选包括：无核酶水2.4μl，pcr反应液10μl，酶混合液0.5μl，rox参比染料0.5μl，所述试剂2μl和标准品或rna 5μl；所述qrt
‑
pcr反应的程序包括：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环；然后根据标准品配制的标准曲线，测算hrh4 mrna的表达量。本发明所述标准曲线，以拷贝数对数值为横坐标(x)，ct值为纵坐标(y)：y＝
‑
3.177x 34.178(r2＝0.996)。本发明对所述rna的来源并没有特殊限定，可提取自人血液、鼻腔分泌物、支气管冲洗液、唾液或泪液样本。
[0045]
下面结合实施例对本发明提供的一种检测人组胺受体hrh4 mrna表达水平的试剂、试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0046]
本发明实施例中所涉及的试剂、试剂盒和仪器，如未特殊说明，均为本领域的常规市售产品：
[0047]
全血总rna试剂盒(杭州新景生物试剂开发有限公司，货号：5201050)；
[0048]
hiscribe t7 highyield rna synthesis kit(new england biolabs，货号：e2050s)；
[0049]
applied biosystems
tm 7300荧光定量pcr仪(thermofisher，美国)；
[0050]
‑
80℃低温冰箱(thermofisher，美国)；
[0051]
高速低温台式离心机(eppendorf，德国)；
[0052]
qubit 3荧光计(thermofisher，美国)。
[0053]
实施例1
[0054]
1、委托上海桑尼生物科技有限公司合成表1所示的引物和探针。
[0055]
2、标准品制备
[0056]
体外转录。采用pgm
‑
t连接试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，货号：vt202
‑
01]，以pgm
‑
t为载体构建hrh4质粒dna(委托南京金斯瑞生物科技有限公司构建及合成，图8)，将hrh4质粒dna用hiscribe t7 high yield rna synthesis kit(new england biolabs公司生产，货号：e2040s)体外转录成mrna。
[0057]
根据拷贝数计算公式：拷贝数＝[6.02
×
10
23
×
rna浓度(ng/μl)
×
10
‑9]/[rna长度(bp)
×
340]，计算rna初始拷贝数。用无核酶水稀释至1.0
×
10
10
copeies/μl，即为hrh4标准品。
[0058]
3、全血rna提取及稀释
[0059]
edta抗凝全血样本用全血总rna试剂盒提取全血总rna，采用qubit3荧光计定量后，用无核酶水稀释至20ng/μl。
[0060]
4、taqman实时荧光定量pcr
[0061]
以标准品/全血rna为模板，配制20μl体系：无核酶水2.4μl，pcr反应液10μl，酶混合液0.5μl，rox参比染料0.5μl，引物和探针混合液2μl和标准品或rna 5μl；
[0062]
程序：42℃30min；95℃1min；95℃5s，60℃31s，40个循环；
[0063]
并设置检测荧光素：fam、joe，参比荧光：rox，反应体系：20μl，荧光信号收集：60℃31sec。
[0064]
5、标准曲线的生成
[0065]
将hrh4标准品按10倍梯度进行稀释，选择1.0
×
108～1.0
×
103copeies/μl作为模板，每个稀释度3个重复，进行taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测，生成标准曲线。
[0066]
结果如图1所示，以拷贝数对数值为横坐标，ct值为纵坐标，得到回归方程式：y＝
‑
3.177x 34.178(r2＝0.996)，说明标准方程的拷贝数对数值与ct值具有极高的相关性。
[0067]
6、精密度检测
[0068]
选择1.0
×
107copies/μl、1.0
×
104copies/μl的标准品作为模板，每个浓度10个重复量，进行10次taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测，分别计算每个浓度对数值的变异系数进行统计学分析，分析该检测方法的精密度。
[0069]
结果如表2和图2所示，每个浓度对数值的变异系数分别为0.443％、0.430％，小于5％，表明本发明建立的taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法具有极好的精密度。
[0070]
表2精密度检测结果
[0071]
理论拷贝数拷贝数对数值均值sdc.v1.0
×
1076.9070.0310.443％1.0
×
1043.9880.0170.430％
[0072]
7、准确度检测
[0073]
选择1.0
×
106copies/μl标准品进行30倍稀释(2μl 1.0
×
106copies/μl标准品 58μl无核酶水)作为模板，3个重复量，进行3次taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测，计算每个浓度对数值的绝对偏差。结果如表3所示，每个浓度对数值的绝对偏差分别为0.126、0.137、0.131，在
±
0.5范围内，表明本发明建立的taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法具有极好的准确度。
[0074]
表3准确度检测数据
[0075][0076]
8、灵敏度检测
[0077]
选择10.0copies/μl标准品作为模板，25个重复量，进行25次taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测，查看是否有扩增抬头，分析该检测方法的灵敏度。
[0078]
结果如表4和图4所示，共计25次检测出结果，达100％，表明本发明建立的taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法具有很高的灵敏度，最低检出拷贝数＜10copies/μl。
[0079]
表4灵敏度检测ct值结果
[0080]
32.53332.71633.51432.32131.94432.11031.96733.33633.21531.50631.67333.51332.74731.74731.96131.60532.96833.15731.96532.18932.76932.17832.69232.46531.669
[0081]
9、临床样本检测
[0082]
取患者和正常人全血样本按照上述进行全血rna提取和稀释，按照上述步骤进行taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测。
[0083]
和国内某品牌组胺h4受体(hrh4)elisa试剂盒比对，结果如表5和图5所示，本发明建立的taqman实时荧光定量rt
‑
pcr检测方法具有比对试剂更好的灵敏度和特异性，同时可以有效监测治疗效果。
[0084]
表5临床样本检测效果对比
[0085][0086]
对比例1、采用其它非最佳引物、探针进行扩增的结果
[0087]
将实施例5中本发明所用体系中的引物、探针替换成其它非最佳引物、探针。结果如图6，在采用非最佳的hrh4引物、探针，标准品曲线扩增结果差，基本没有扩增。
[0088]
非最佳的hrh4引物、探针：
[0089]
hrh4
‑
f(seq id no.7)：gccagatactaatagcacaat；
[0090]
hrh4
‑
r(seq id no.8)：ccacaaaagctaaaatgaccaa
[0091]
h4
‑
probe(seq id no.9)：(fam)
‑
aagcactcgtgttactttagca
‑
(bhq1)。
[0092]
对比例2、酶混合液效果比较
[0093]
用非最佳配比的酶混合液(taq酶、逆转录酶、rna酶抑制剂和taq酶抗体的质量比为16:3:5:1)和最佳配比的酶混合液分别扩增校准曲线上1.0
×
103‑
1.0
×
106copies/μl 4个梯度，采用非最佳的酶混合液配比的扩增结果如图7中a所示，采用最佳的酶混合液配比的扩增结果如图7中b所示。可见最佳酶混合液的扩增效果较好。
[0094]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。