一种早期胚胎的联合激活装置和方法

1.本技术涉及胚胎工程技术领域，特别是涉及一种早期胚胎的联合激活装置和方法。


背景技术：

2.在胚胎工程技术中，在早期胚胎显微操作流程的各个阶段进行早期胚胎激活是一种常用手段。在自然受精过程中，卵母细胞的细胞质激活是由精子的进入并诱导钙振荡来完成的。而在孤雌激活(pa)、胞浆内单精子注射(icsi)、体细胞核移植中，卵母细胞的人工辅助激活是必不可少的。目前已知的人工辅助激活方式主要分为单一激活和联合激活。常用的单一激活主要有机械激活、电激活、化学激活(钙离子载体a23187、离子霉素(ionomycin)及乙醇等)；联合激活主要是先单纯的物理激活或化学激活，之后再用蛋白质合成抑制剂、蛋白质磷酸化抑制剂或细胞松弛素b联合处理的一种激活方式。现在越来越多的研究证明联合激活比单一的电激活或化学激活效果好。
3.目前，常用的联合激活是先对早期胚胎进行电激活然后再将早期胚胎浸泡在包含化学物的溶液中以对早期胚胎进行化学激活，装置较为粗糙，精度很低。电激活是使用具有两块平行板电极的激活室来对一批早期胚胎进行电激活，由于宏观平行板电极的间距较大，针对单个早期胚胎的施加电刺激电压也较大并且分布不够均匀，极易对胚胎造成过度电损伤，并且无法完成对早期胚胎特定部位实施精准电刺激；无法用一套激活装置完成对早期胚胎的电激活和化学激活的联合激活流程。
4.因此，如何实现对早期胚胎的特定部位进行刺激，以及实现一套激活装置完成对早期胚胎的联合激活，提高早期胚胎激活率是本领域技术人员亟需要解决的问题。


技术实现要素：

5.本技术的目的是提供一种面向早期胚胎的联合激活装置和方法，用于实现对早期胚胎的特定部位进行包括电刺激和化学刺激在内的联合刺激，以及实现一套激活装置完成对早期胚胎的联合激活，从而提高早期胚胎激活率。
6.为解决上述技术问题，本技术提供一种早期胚胎的联合激活装置，包括：
7.培养皿，用于存放早期胚胎；
8.细胞吸持机构，用于调整所述早期胚胎的位姿，并固定所述早期胚胎；
9.联合激活机构，所述联合激活机构包括毛细微针和第一持针仪，所述毛细微针与所述第一持针仪连接；所述毛细微针包括液体金属通道和化学物质通道；所述液体金属通道内设有液体金属和导线，所述液体金属位于所述毛细微针尖端，所述导线用于连接激励电源，所述液体金属和所述导线构成液态金属电极用于对所述早期胚胎进行电激活；所述化学物质通道用于释放化学物质对所述早期胚胎进行化学激活。
10.优选地，所述毛细微针包括多个所述液体金属通道和一个所述化学物质通道，多个所述液体金属通道围绕一个所述化学物质通道设置。
11.优选地，所述培养皿的底部设有阵列的微坑，所述微坑用于防止所述早期胚胎的移动。
12.优选地，所述第一持针仪包括第一旋盖、第二旋盖、第一连接座、第三旋盖和第一固定杆；
13.所述第一旋盖与所述第二旋盖螺纹连接，所述第二旋盖、所述第三旋盖均与所述第一连接座螺纹连接，所述第一固定杆与所述第三旋盖螺纹连接；
14.所述毛细微针尾部贯穿所述第一旋盖和所述第二旋盖，所述第一连接座设有气压驱动入口，所述毛细微针中的所述化学物质通道与所述气压驱动入口连通。
15.优选地，所述细胞吸持机构包括细胞吸持针和第二持针仪，所述细胞吸持针与所述第二持针仪连接，所述第二持针仪上设有导气口，所述导气口与所述细胞吸持针连通。
16.优选地，所述液体金属通道的直径为7μm。
17.优选地，所述化学物质通道的直径为10μm。
18.优选地，所述细胞吸持针的内径为15μm，外径为100μm。
19.优选地，所述微坑直径为150μm，深度为50μm。
20.本技术还提供一种早期胚胎的联合激活方法，应用于所述的早期胚胎的联合激活装置，包括：
21.在细胞吸持机构固定早期胚胎之后，控制联合激活机构向所述早期胚胎的目标部位持续通入高压直流脉冲，以对所述早期胚胎进行电激活；
22.在所述早期胚胎经过电激活后，控制所述联合激活机构释放化学物质以对所述早期胚胎进行化学激活。
23.本技术所提供的一种早期胚胎的联合激活装置，包括：培养皿，用于存放早期胚胎；细胞吸持机构，用于调整早期胚胎的位姿，并固定早期胚胎；联合激活机构，联合激活机构包括毛细微针和第一持针仪，毛细微针与第一持针仪连接；毛细微针包括液体金属通道和化学物质通道；液体金属通道内设有液体金属和导线，液体金属位于毛细微针尖端，导线用于连接激励电源，液体金属和导线构成液体金属电极用于对早期胚胎进行电激活；化学物质通道用于释放化学物质对早期胚胎进行化学激活。本技术的毛细微针可实现对单个早期胚胎局部部位如核物质区域的精确联合激活，减少对早期胚胎其他部位过度的电损伤或化学损伤，从而提升早期胚胎激活率；并且一个联合激活机构集成了电激活和化学激活，提高对早期胚胎联合激活的便捷性；细胞吸持机构可快速调整细胞的位姿，缩减时间，减少因调整细胞位姿而导致细胞死亡或者停滞发育的因素。
24.本技术实施例所提供的一种早期胚胎的联合激活方法与装置对应，效果如上。
附图说明
25.为了更清楚地说明本技术实施例，下面将对实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本技术实施例提供的一种早期胚胎的联合激活装置的结构图；
27.图2为本技术实施例提供的一种培养皿的结构图；
28.图3为本技术实施例提供的一种联合激活机构的结构图；
29.图4为本技术实施例提供的一种毛细微针的针尖结构图；
30.图5为本技术实施例提供的一种毛细微针的针尖横截面示意图；
31.图6为本技术实施例提供的一种毛细微针的内部结构图；
32.图7为本技术实施例提供的一种毛细微针针尖的工艺制备流程图；
33.图8为本技术实施例提供的一种细胞吸持机构的结构图；
34.图9为本技术实施例提供的一种早期胚胎的联合激活方法的流程图；
35.附图标记如下：1为培养皿、2为联合激活机构、3为细胞吸持机构、4为细胞、101为微坑、201为毛细微针、202为第一旋盖、203为第二旋盖、204为第一连接座、205为第三旋盖、206为第一固定杆、207为气压驱动入口、208为导线出口、209为第一环形垫圈、210为第二环形垫圈、211为化学物管道、2011为液体金属通道、2012为化学物质通道、2013为导线、301为细胞吸持针、302为第四旋盖、303为第五旋盖、304为第二连接座、305为第六旋盖、306为第二固定杆、307为导气口、308为气体管道、309为第三环形垫圈、310为第四环形垫圈、a为毛细微针的针尖、b为细胞吸持针的针尖。
具体实施方式
36.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护范围。
37.目前，有关哺乳动物早期胚胎激活的研究已经做了很多，方法由原来的单一激活到现在的各种方法的联合使用，已取得了一定的进展。电激活是常用的激活方法，因该方法具有操作方便、激活率高和无化学毒副作用等特点而被广大研究者所青睐。电激活的原理是早期胚胎在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞，使细胞外的ca 进入细胞，并使胞质内ca 浓度升高，细胞内ca2 浓度的增加导致csf活性消失，cyclinb被迅速降解，mpf活性消失，细胞被激活完成第二次减数分裂并进入下一细胞周期。化学激活主要包括钙离子载体a23187、离子霉素、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂和蛋白质磷酸化抑制剂。钙离子载体a23187(caa)主要通过胞质内ca2 的释放来激活早期胚胎。离子霉素作为另一种钙离子载体，也是通过早期胚胎内ca2 的释放而发挥功能的。但是它不是直接促进早期胚胎内ca2 的释放，而是先动用细胞膜上ca2 通道由细胞外向胞内涌入，然后又激活内源性内质网中的ca2 进入早期胚胎胞质内。乙醇对早期胚胎的激活主要是引起细胞膜ip3的形成，通过ip3,受体介导内源性ca2 释放，引起早期胚胎产生激活的早期反应。蛋白类细胞因子成熟促进因子(mpf)和细胞静止因子(csf)是细胞周期的调节者，正是因为在二者的作用下卵母细胞才会停滞在mⅱ期。这些因子对ca2 十分敏感，当卵激活胞质ca2 升高到一定水平时，mpf和csf便失活或消失。使用蛋白质合成抑制剂激活早期胚胎不是因为能引起ca2 浓度波动而起作用，而是因为能抑制这些蛋白质类细胞因子的合成，从而使早期胚胎离开mⅱ期，恢复第二次减数分裂。蛋白质磷酸化抑制剂能阻止蛋白质的磷酸化进而抑制mpf和csf的活性，同时也抑制了第二极体的排放，保证了孤雌激活卵母细胞的染色体为二倍体。
38.本技术的核心是提供一种早期胚胎的联合激活装置和方法。
39.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面结合附图(图1-图8)和具体实施方式对本技术作进一步的详细说明。
40.图1为本技术实施例提供的一种早期胚胎的联合激活装置的结构图，如图1所示，1为培养皿、2为联合激活机构、3为细胞吸持机构、4为细胞。培养皿1，用于存放早期胚胎；细胞吸持机构3，用于调整早期胚胎的位姿，并固定早期胚胎；联合激活机构2，联合激活机构2包括毛细微针201和第一持针仪，毛细微针201与第一持针仪连接；毛细微针201包括液体金属通道2011和化学物质通道2012；液体金属通道2011内设有液体金属和导线2013，液体金属位于毛细微针201尖端，导线2013用于连接激励电源，液体金属和导线2013构成液态金属用于对早期胚胎进行电激活；化学物质通道2012用于释放化学物质对早期胚胎进行化学激活。
41.本技术实施例所提供的一种早期胚胎的联合激活装置，包括：培养皿，用于存放早期胚胎；细胞吸持机构，用于调整早期胚胎的位姿，并固定早期胚胎；联合激活机构，联合激活机构包括毛细微针和第一持针仪，毛细微针与第一持针仪连接；毛细微针包括液体金属通道和化学物质通道；液体金属通道内设有液体金属和导线，液体金属位于毛细微针尖端，导线用于连接电源，液体金属和导线构成电极用于对早期胚胎进行电激活；化学物质通道用于释放化学物质对早期胚胎进行化学激活。本技术的毛细微针可实现对单个早期胚胎局部部位如核物质区域的精确联合激活，减少对早期胚胎其他部位过度的电损伤或化学损伤，从而提升早期胚胎激活率；并且一个联合激活机构集成了电激活和化学激活两种功能，提高对早期胚胎联合激活的便捷性；细胞吸持机构可快速调整细胞的位姿，缩减时间，减少因调整细胞位姿而导致细胞死亡或者停滞发育的因素。
42.本技术实施例对培养皿1形状和规格不作具体限定，图2为本技术实施例提供的一种培养皿的结构图，如图2所述，培养皿1的底部设有阵列的微坑101，微坑直径为150μm，深度为50μm。培养皿1相当于整个装置的操作台，细胞4放在培养皿1里，底部的微坑101使早期胚胎不能轻易的流动，方便抓取。
43.图3为本技术实施例提供的一种联合激活机构的结构图，如图3所示，联合激活机构2包括毛细微针201和第一持针仪。第一持针仪包括第一旋盖202、第二旋盖203、第一连接座204、第三旋盖205、第一固定杆206、气压驱动入口207、导线出口208、第一环形垫圈209、第二环形垫圈210、化学物管道211。a为毛细微针201的针尖部分。第一旋盖202与第二旋盖203螺纹连接，第二旋盖203、第三旋盖205均与第一连接座204螺纹连接，第一固定杆206与第三旋盖205螺纹连接；毛细微针201尾部贯穿第一旋盖202和第二旋盖203，第一连接座204设有气压驱动入口207，毛细微针201中的化学物质通道2012通过化学物管道211与气压驱动入口207连接。当然，在毛细微针201的侧壁靠近尾部设有通孔，对应的第二旋盖203设有导线出口208，方便液体金属通道2011中的导线2013引出。本技术实施例对毛细微针中的化学物质通道2012和液体金属通道2011的个数不作具体限定，毛细微针201可以包括多个液体金属通道2011和一个化学物质通道2012。气压驱动入口207可以与显微注射泵连接，显微注射泵增加化学物质通道2012的气体压强，以使化学物质通道2012中的化学物释放出来。图4为本技术实施例提供的一种毛细微针的针尖结构图，图5为本技术实施例提供的一种毛细微针的针尖横截面示意图，结合图4和图5，包括6个液体金属通道2011和一个化学物质通道2012，6个液体金属通道2011围绕一个化学物质通道2012设置；液体金属通道2011的直径
为7μm，化学物质通道2012的直径为10μm。图6为本技术实施例提供的一种毛细微针的内部结构图，如图6所示，液体金属通道2011内设有液体金属和导线2013，液体金属位于毛细微针201的针尖，导线2013从针尖至靠近针尾的通孔引出，导线2013用于连接电源，液体金属与导线2013构成电极可对细胞进行电激活。为了便于联合激活机构2的位置调整，第一持针仪的第一固定杆206可以与机械臂(图中未示出)连接，通过控制机械臂实现联合激活机构的位置调整。第一持针仪中的第一环形垫圈209和第二环形垫圈210用于在受到旋盖的挤压时发生形变固定毛细微针201的尾部。本技术实施例中的毛细微针201与第一持针仪可拆卸连接，可以方便更换毛细微针201。
44.为了更加清楚地了解上述联合激活机构的结构，图7为本技术实施例提供的一种毛细微针针尖的工艺制备流程图，下面结合图7介绍联合激活机构中毛细微针的针尖的工艺制备流程：
45.(1)拉制玻璃管形成毛细微针。作为优选方案，用毛细微针拉针仪加热并拉制玻璃管至设定形状和尺寸，对玻璃管拉伸之前，玻璃管为预制的，玻璃管形状为中间有直径1mm的化学物质通道，围绕化学物质通道周围有六个直径为0.7mm的微管(液态金属通道)。玻璃管被拉针仪加热并拉制成一个10μm的化学物质通道和六个7μm的液态金属通道。
46.(2)从毛细微针玻璃管尾部向六根直径为7μm的玻璃微管注入液态金属。作为优选方案，用高精度注射器从毛细微针尾部注入液态金属，本装置中液态金属为镓基液态金属，但液态金属不限于镓基液态金属。在注入液态金属时需要将化学物质通道堵塞，避免液态金属流入化学物质通道。
47.(3)将液态金属甩向毛细微针尖端。作为优选方案，利用离心机高转速产生的巨大离心力将液态金属甩向毛细微针尖端，直至在显微镜下观察液态金属填满针尖同时没有气泡，在离心机工作前，设置离心机的转速为6500r/min，持续时间1-2分钟，也可以根据毛细微针的直径进行转速和时间的调整。
48.(4)修剪毛细微针电极尖端。作为优选方案，利用锻针仪修剪毛细微针尖端，使得修剪后的尖端直径满足要求，经过锻针仪截断及打磨，最后尖端形成10μm的化学物质通道和7μm的液态金属通道。在液态金属氧化凝固前，毛细微针玻璃管尾部引出六根导线，从毛细微针玻璃管尾部引出导线以用于连接电源，形成液态金属毛细微针电极。液态金属暴露于空气中表面很快被氧化形成一层薄薄的约1nm的固态氧化膜，这有助于稳定液态金属毛细微针电极的形状，避免液态金属从毛细微针尖端处流出，影响毛细微针电极的性能。
49.图8为本技术实施例提供的一种细胞吸持机构的结构图，如8所示，细胞吸持机构包括细胞吸持针301和第二持针仪，细胞吸持针301与第二持针仪连接，第二持针仪上设有导气口307，导气口307与细胞吸持针301连通。第二持针仪包括第四旋盖302、第五旋盖303、第二连接座304、第六旋盖305、第二固定杆306、导气口307、气体管道308、第三环形垫圈309、第四环形垫圈310。b为细胞吸持针的针尖。本技术实施例对细胞吸持针301的不作具体限定，细胞吸持针301的针尖使用预制的玻璃软管制造，内径为15μm，外径为100μm，在工作时利用负压的原理将早期胚胎吸住，使细胞处于一个相对稳定状态，细胞吸持机构3可随时放下或者吸持细胞，更重要的一点是，在细胞被放置在培养皿上时，将细胞吸持机构3移动到细胞周围不同的位置，然后再将细胞吸持，实现调整细胞位姿的目的，非常便利的，具有很高的便利性和重复性。为了便于细胞吸持机构3的位置调整，第二持针仪的第二固定杆
306可以机械臂(图中未示出)连接，通过控制机械臂实现细胞吸持机构3的位置调整。第二持针仪中的第三环形垫圈309和第四环形垫圈310用于在受到旋盖的挤压时发生形变固定细胞吸持针301的尾部。
50.在上述实施例中，对于早期胚胎的联合激活装置进行了详细描述，本技术还提供早期胚胎的联合激活方法对应的实施例。
51.图9为本技术实施例提供的一种早期胚胎的联合激活方法的流程图，如图9所示，早期胚胎的联合激活方法包括：
52.s10：在细胞吸持机构固定早期胚胎之后，控制联合激活机构向早期胚胎的目标部位持续通入高压直流脉冲，以对早期胚胎进行电激活。
53.s11：在早期胚胎经过电激活后，控制联合激活机构释放化学物质以对早期胚胎进行化学激活。
54.上述方法可以是通过与细胞吸持机构和联合激活机构相连接的控制器进行控制。早期胚胎的目标部位包括核物质区等。具体的过程如下：
55.(1)早期胚胎固定阶段：利用小鼠或者猪的卵母细胞与精子进行体外融合，形成受精卵。将早期胚胎放置在培养皿上，再用细胞吸持机构3将其固定，防止早期胚胎发生移动或者旋转。
56.(2)早期胚胎的激活阶段：使用联合激活机构2对早期胚胎进行激活，电激活过程中，持续通入较高压直流脉冲，电压大小为3.2v，脉宽为50～100μs，当早期胚胎受到电激活后，细胞膜的通透性增加，此时释放化学物质溶液通过细胞膜进入早期胚胎，快速激活早期胚胎内的一系列代谢反应。
57.(3)早期胚胎调整位姿阶段：当使用联合激活机构2激活早期胚胎的一侧细胞膜后，应该改变细胞的姿态，此时应使用细胞吸持机构3(负压的原理)调整早期胚胎的姿态，在早期胚胎被放置在培养皿上时，将细胞吸持机构3移动到早期胚胎周围不同的位置，然后再将早期胚胎吸持，实现调整胚胎位姿的目的，调整完后再重复胚胎激活阶段的操作。
58.本技术实施例所提供的一种早期胚胎的联合激活方法，电激活早期胚胎的细胞膜，导致膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞，此时化学激活释放的钙离子载体，离子霉素等通过微小孔洞进入细胞，激活了早期胚胎中一系列的代谢反应，达到胚胎的发育成活率大大增加的目的，对于早期胚胎体外发育过程具有重大意义。
59.以上对本技术所提供的一种早期胚胎的联合激活装置和方法进行了详细介绍。说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以对本技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本技术权利要求的保护范围内。
60.还需要说明的是，在本说明书中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那
些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。