水稻耐高温调控基因Hsp70的分子标记及其应用的制作方法

水稻耐高温调控基因hsp70的分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻耐高温调控基因hsp70的分子标记及其应用。


背景技术：

2.水稻是全世界近一半人口的主粮，同时，也是我国最重要的粮食作物。但是随着全球气候变暖，高温对水稻生产造成了严重影响，在水稻抽穗开花期遇到高温天气，会导致水稻结实率下降，造成水稻减产；在水稻灌浆期遇到高温天气会影响水稻籽粒充实度，水稻产量以及大米品质都会下降。因此，培育耐高温水稻品种对于确保高温条件下水稻产量和大米品质具有重要意义。大量研究表明，水稻对高温的耐受性受到内在遗传机制和外界环境因子的双重因素调节。因此，了解水稻耐高温的遗传规律，通过改良水稻对高温的耐受性，对于确保水稻在遭遇高温天气时的高产稳产和确保大米品质具有重要的意义。
3.近年，随着遗传学和分子生物学技术的发展，调控水稻耐高温的基因tt1(li et al.,nature genetics,2015,47(7):827-33)、slg1(xu et al.,nature communications,2020,11(1):5441)等被克隆。其中有研究表明来源于非洲稻cg14中的tt1转入水稻中可以提高水稻对高温的耐受性(li et al.,nature genetics,2015,47(7):827-33)。突变体slg1茎秆纤细，粒长增加，体内trna硫醇化水平降低，对高温敏感；过表达slg1能显著提高水稻对高温耐受性。slg1在籼粳两亚种之间有分化，启动子和编码区的变异导致籼稻品种硫醇化trna水平的提高和耐热性的增强(xu et al.nature communications,2020,11(1):5441)。
4.分子标记辅助选择是一种利用与耐高温基因紧密连锁标记或者基因内功能标记，在后代中结合基因型和表型鉴定对目标性状进行选择的现代育种技术。该方法不仅可大大缩短育种年限，提高育种效率，而且还节约了大量的人力、物力成本。因此在改良水稻高温耐受性，确保水稻在高温环境下的高产稳产方面有很大的应用价值，开发耐高温基因的功能性标记对充分利用该基因，进一步改良水稻对高温的耐受性，对确保粮食安全具有重要意义。


技术实现要素：

5.基于此，本发明的目的在于提供一种水稻耐高温基因hsp70的分子标记、及其正反引物与应用。具体技术方案如下：
6.一种水稻耐高温基因hsp70的分子标记，所述分子标记为耐高温基因hsp70-12，用于扩增所述分子标记的引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
7.在其中一些实施例中，所述分子标记位于水稻基因组第1号染色体。
8.在其中一些实施例中，所述分子标记的大小为131bp和/或119bp。
9.在其中一些实施例中，所述分子标记的核苷酸序列为seq id no.3和/或seq id no.4。
10.本发明还提供了一种与水稻耐热特性相关的分子标记的获得方法，具体技术方案如下：
11.一种与水稻耐热特性相关的分子标记的获得方法，包括以下步骤：
12.分别以水稻品种旱恢3号和沪旱1b的基因组dna为模板，采用核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物进行pcr扩增；
13.将所述pcr扩增得到的产物经电泳分离后，得到的大小为131bp的扩增片段或大小为119bp的扩增片段，即为目标分子标记。
14.本发明还提供了水稻耐高温基因hsp70的分子标记的应用，具体如下：
15.水稻位于1号染色体上的分子标记在水稻耐高温特性的鉴定中的应用和/或在耐高温水稻的辅助选择育种中的应用。
16.本发明还提供了一种分子标记用于水稻耐高温调控基因hsp70的鉴定的方法，具体技术方案如下：
17.一种分子标记用于水稻耐高温调控基因hsp70的鉴定的方法，包括以下步骤：
18.1)提取供试水稻样品基因组dna；
19.2)利用核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行pcr扩增，获得扩增产物；
20.在其中一些实施例中，通过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤2)得到的pcr产物，如果有131bp的条带，则表示所述样品为高温敏感品种旱恢3号等位基因型；如果有119bp的条带，则表示该检测样品基因型为耐高温品种沪旱1b等位基因。
21.在其中一些实施例中，所述pcr扩增的扩增体系包含：taq酶，模板dna，dntp，核苷酸序列如seq id no.1和seq idno.2所示的引物，pcr buffer。
22.在其中一些实施例中，其特征在于，所述pcr扩增的pcr反应程序为：95
±
1℃预变性4-6min，然后按98
±
1℃20s，54.5
±
0.5℃下15-25s，71
±
1℃下20-30s进行32个循环，最后71
±
1℃下延伸4-6min。本发明还提供了一种分子标记用于耐高温水稻的辅助选择育种的方法，具体技术方案如下：
23.一种分子标记用于耐高温水稻的辅助选择育种的方法，包括以下步骤：
24.1)提取供试水稻样品基因组dna；
25.2)利用核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物对步骤1)中所提取基因组进行pcr扩增，获得扩增产物。
26.在其中一些实施例中，通过6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤2)得到的pcr产物，如果有131bp的条带，则表示所述样品为高温敏感品种等位基因型；如果有119bp的条带，则表示该检测样品基因型为耐高温品种等位基因。
27.本发明还提供了一种水稻耐高温调控基因hsp70的鉴定的试剂盒，具体技术方案如下：
28.一种水稻耐高温调控基因hsp70的鉴定的试剂盒，包括：核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示的引物，所述引物用于扩增水稻耐高温调控基因hsp70的分子标记，所述分子标记为hsp70-12。
29.基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
30.本发明的一种可以鉴定水稻耐高温调控基因hsp70的分子标记、及其正反引物与
并可将其应用于水稻耐高温性状的筛选与育种。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，更为简便；可以缩短育种周期，提高育种效率。
附图说明
31.图1是本发明中分子标记hsp70-12对24个水稻品种的电泳检测图。
32.图2是本发明中hsp70-12分子标记在不同群体耐高温表现评价中的验证结果。
具体实施方式
33.为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
34.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
35.下面通过实施例对本发明进行详细介绍：
36.实施例1水稻耐高温调控基因hsp70基因分子标记的开发
37.(1)供试材料：高温敏感品种：旱恢3号；耐高温品种：沪旱1b。
38.(2)水稻基因组dna提取方法：在研钵中，取10mg水稻叶片，加入适量的液氮，将水稻叶片研磨成粉末，加入400μl 1.5
×
ctab(1.5％ctab,75mmol/l tris-hcl,15mmol/l edta,1.05mol/l nacl,ph＝8.0)研磨成匀浆，再加入400μl 1.5
×
ctab，吸取研磨液至1.5ml离心管中，加入550μl氯仿，混匀，12000r/min离心10min，取上清至另一离心管，加入预冷的等体积异丙醇，12000r/min离心5min，去上清，干燥沉淀物，最后加入200μl ddh2o溶解即可。
39.(3)基因分子标记hsp70-12的开发：hsp70位于第1号染色体，在日本晴参考基因组收录号为os01g0721000。
40.(4)根据对高温敏感品种和耐高温品种的基因核苷酸序列差异分析，设计引物hsp70-12，其正反引物序列为：
41.hsp70-12 f：5
’‑
ctcctcgacaagctgatgttc-3’(seq id no.1)；
42.hsp70-12 r：5
’‑
ctcgcgacgccaactatgt-3’(seq id no.2)。
43.(5)利用功能标记hsp70-12对供试水稻品种旱恢3号与沪旱1b进行pcr扩增，pcr扩增体系为：20ng/μl水稻基因组dna模板1μl，10μl的2
×
taq master mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，10μm的前后引物各1μl，补充dd h2o至20μl。95
±
1℃预变性4-6min，然后按98℃20s，54.5℃下20s，72℃下20s进行32个循环，最后72℃下延伸4min。
44.(7)pcr产物2μl上样于6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果如图1所示，第23泳道为敏感品种旱恢3号，条带大小为131bp。第24泳道为沪旱1b的pcr产物，条带大小为119bp。
从图1可以看出电泳条带清晰，差异明显。
45.(8)电泳切胶回收/测序。胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的胶回收试剂盒(离心柱型，产品目录号:eg101-02)，测序由上海博尚生物技术有限公司完成。测序结果见表1。
46.表1：旱恢3号与沪旱1b的相应分子标记位点碱基比较
[0047][0048][0049]
旱恢3号：(seq id no.3)
[0050]
ctcctcgacaagctgatgttcggccggcagaaggaggtggagcaggtcgttggattcctgctgcagccggacgtctgcggcgctggcgccggcgccggcgccggcgtgctgcacatagttggcgtcgcgag
[0051]
沪旱1b(seq id no.4)
[0052]
ctcctcgacaagctgatgttcggccggcagaaggaggtggagcaggtcgttggattcctgctgcagccggacgtctgcggcgctggcgccggcgtgctgcacatagttggcgtcgcgag
[0053]
实施例2：hsp70-12分子标记的亲本多态性检测
[0054]
(1)提取供试水稻品种基因组，提取方法同实施例1。供试水稻品种分别为：旱恢15、沪旱15、旱稻8号、绿旱1号、秀水115、培c122、irat13、milt1444、iac1、科青3号、ku70-1、公居3号、cartuna、良国早、三颗寸、cica4、bico preto、山酒谷、c418、mifor 6-2、香糯、宁恢21。
[0055]
(2)pcr扩增，同实施例1。
[0056]
(3)酶切，同实施例1。
[0057]
(4)电泳检测，同实施例1。结果如图1所示。
[0058]
其中m表示marker：50bp dna ladder。除m泳道外，从左至右依次为1-22泳道，分别对应水稻品种旱恢15(耐热系数为0.43)、沪旱15(耐热系数为0.50)、旱稻8号(耐热系数为0.21)、绿旱1号(耐热系数为0.80)、秀水115(耐热系数为0.41)、培c122(耐热系数为0.10)、irat13(耐热系数为0.09)、milt1444(耐热系数为0.07)、iac1(耐热系数为0.26)、科青3号(耐热系数为0.62)、ku70-1(耐热系数为0.15)、公居73号(耐热系数为0.73)、cartuna(耐热系数为0.73)、良国早(耐热系数为0.73)、三颗寸(耐热系数为0.72)、cica4(耐热系数为0.37)、bico preto(耐热系数为0.41)、山酒谷(耐热系数为0.13)、c418(耐热系数为0.35)、
mifor 6-2(耐热系数为0.09)、香糯(耐热系数为0.07)、宁恢21(耐热系数为0.08)。
[0059]
可见，含有耐高温等位基因的品种旱恢15(第1泳道)、沪旱15(第2泳道)、绿旱1号(第4泳道)、科青3号(第10泳道)、公居73号(第12泳道)、cartuna(第13泳道)、良国早(第14泳道)、三颗寸(第15泳道)的电泳条带大小为119bp。而高温敏感等位基因品种旱稻8号(第3泳道)、秀水115(第5泳道)、培c122(第6泳道)、irat13(第7泳道)、milt1444(第8泳道)、iac1(第9泳道)、ku70-1(第11泳道)、cica4(第16泳道)、bico preto(第17泳道)、山酒谷(第18泳道)、c418(第19泳道)、mifor 6-2(第20泳道)、香糯(第21泳道)、宁恢21(第22泳道)的电泳条带大小为131bp。
[0060]
总结对比如下：
[0061]
[0062]
[0063][0064]
根据上述结果对比可见，水稻的耐热系数与电泳检测hsp70-12分子标记扩增产物的条带大小相关，含有电泳条带大小为119bp的等位基因的水稻耐热系数高，耐热特性好。而含有电泳条带为131bp的等位基因的水稻耐热系数低，对于高温敏感。
[0065]
实施例3：hsp70-12分子标记的验证与应用
[0066]
(1)沪旱1b/旱恢3号重组自交系群体耐高温表现验证：利用hsp70基因分子标记hsp70-12对水稻耐高温品种沪旱1b与高温敏感品种旱恢3号的174个重组自交系(f
10
)的基因组dna进行pcr扩增，pcr产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，分别有56个株系含有旱恢3号的等位基因型(131bp条带)、118个株系含有与沪旱1b一致的等位基因型(119bp条带)，耐热系数鉴定结果表明，含有旱恢3号的等位基因型的株系耐热系数(相对结实率)极显著小于含有沪旱1b等位基因型株系的耐热系数(相对结实率)(2018年统计检验p＝2.04e-06，2019年统计检验p＝2.33e-08)(图2中a所示)。rssr为耐热系数(相对结实率)＝高温大棚内水稻结实率/正常水田水稻结实率。
[0067]
(2)水稻种质资源耐高温鉴定表现验证：利用hsp70基因分子标记hsp70-12对150份水稻种质资源的基因组dna进行hsp70基因型鉴定，pcr产物在6％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，发现其中79份种质资源为119bp带型，71份种质资源条带大小131bp，含有119bp带型的种质资源耐热系数极显著大于含有131bp带型的种质资源(p＝9.44e-04)(图2，b)。
[0068]
其中，图中hsp70-in代表131bp带型对应的基因型，hsp70-de代表119bp带型对应的基因型。
[0069]
因此表明可以利用分子标记hsp70-12进行水稻耐高温基因hsp70的鉴定和/或耐高温水稻的辅助选择育种。
[0070]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0071]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。