用于鉴定罗氏沼虾性别的引物组、试剂盒、鉴别方法以及应用与流程

1.本技术涉及罗氏沼虾性染色体分子学鉴定的技术领域，尤其涉及用于鉴定罗氏沼虾性别的引物组、试剂盒、鉴别方法以及应用。


背景技术：

2.罗氏沼虾(macrobrachium rosenbergii)是一种大型淡水虾，隶属于节肢动物门甲壳纲十足目长臂虾科沼虾属。其作为一种重要的经济虾类，广泛分布于南亚和东南亚以及西太平洋地区。其雌雄个体间存在着显著差异的生长和发育速率，性成熟后，雄性个体显著比雌性个体大，经济效应较高。培育全雄种群的罗氏沼虾，是提高产量的有效策略。且单性化养殖产量要高于常规的雌雄混养，因此利用单性化养殖可大幅度提高养殖经济效益。
3.在甲壳动物中，促雄腺是雄性特有的关键器官，在甲壳动物的雄性性腺发育和第二性征的发育中起着关键的作用(sagi a,dan c,milner y.effect of androgenic gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male freshwater prawns,macrobrachium rosenbergii[j].gen.comp.endocrinol.1990,77(1):15
‑
22.)。切除或移植促雄腺可以控制性别分化方向，该方面已在罗氏沼虾性别分化的研究中有所报道。将雄性沼虾的促雄腺切除，可以得到雌性化的个体。此类个体可与正常的雄性个体交配，获得罗氏沼虾全雄群体(aflalo ed,hoang ttt,nguyen vh,et al.a novel two
‑
step procedure for mass production of all
‑
male populations of the giant freshwater prawn macrobrachium rosenbergii[j].aquaculture.2006,256(1):468
‑
478.)。
[0004]
然而，在对罗氏沼虾杂交育种过程中，准确鉴定其性别具有十分重要的意义。然而罗氏沼虾作为十足目动物，其染色体数目较多，而且其性染色体小，分型困难。因此，建立有效扩增其性染色体dna的方法尤为关键。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本技术的目的在于至少提供一种有效扩增罗氏沼虾性染色体dna的方法，并且以此方法能够有效鉴别罗氏沼虾性别，以在其杂交育种和基因分型中得以应用。
[0006]
第一方面，本技术实施例公开了用于pcr扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组，包括如seq id no.1～2所示的第一引物对、如seq id no.3～4所示的第二引物对和如seq id no.5～6所示的第三引物对中的至少一对。
[0007]
在本技术实施例中，所述第一引物对的靶标序列如seq id no.7所示，所述第二引物对的靶标序列如seq id no.8所示，所述第三引物对的靶标序列如seq id no.9所示。
[0008]
第二方面，本技术实施例公开了一种鉴定罗氏沼虾性别的试剂盒，包含如seq id no.1～2所示的第一引物对、如seq id no.3～4所示的第二引物对和如seq id no.5～6所示的第三引物对中的至少一对。
[0009]
第三方面，本技术实施例公开了一种罗氏沼虾的性别鉴定方法，包括以下步骤：
[0010]
提取罗氏沼虾肌肉组织的基因组dna；
[0011]
pcr扩增所述基因组dna，利用如seq id no.1～2所示的第一引物对、如seq id no.3～4所示的第二引物对和如seq id no.5～6所示的第三引物对中的至少一对进行pcr扩增得到扩增产物；
[0012]
检测所述扩增产物，根据检测结果确定所述罗氏沼虾的性别。
[0013]
在本技术实施例中，使用所述第一引物对扩增所述基因组dna，对扩增产物进行电泳检测；若电泳条带包括一545bp的条带，则罗氏沼虾为雄性；若电泳条带包括一545bp的条带和一390bp的条带，则罗氏沼虾为雌性。
[0014]
在本技术实施例中，使用所述第二引物对扩增所述基因组dna，对扩增产物进行电泳检测；若电泳条带包括一119bp条带，则罗氏沼虾为雌性；若电泳条带未扩增出条带，则罗氏沼虾为雄性。
[0015]
在本技术实施例中，使用所述第二引物对扩增所述基因组dna，对扩增产物进行定量分析，相对表达量大的样本对应的罗氏沼虾为超雌性，相对表达量小的样本对应的罗氏沼虾为雌性，无表达量的样本对应的罗氏沼虾为雄性个体。
[0016]
在本技术实施例中，使用所述第三引物对扩增所述基因组dna，对扩增产物进行定量分析，相对表达量大的样本对应的罗氏沼虾为雄性，相对表达量小的样本对应的罗氏沼虾为雌性，无表达量的样本对应的罗氏沼虾为超雌性个体。
[0017]
在本技术实施例中，所述pcr扩增的扩增体系包括：8.5μl mix体系、各0.25μl 10μm的上下游引物，1μl100 ng/μl的基因组dna作为模板；其中，所述mix体系包含100mm kcl、20mm tris
‑
cl、3mm mgcl2、0.4mm dntp混合物、0.1u/μltaq dna聚合酶；
[0018]
所述pcr扩增程序为，依次进行的95℃处理5min、95℃处理30s和60℃处理30s，共30个循环后，继续依次进行72℃处理30s和72℃处理10min。
[0019]
第四方面，本技术实施例公开了第一方面所述的引物组、第二方面所述的试剂盒在鉴定罗氏沼虾性别、杂交育种或基因分型中的应用。
[0020]
与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
[0021]
本技术实施例提供了扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组以及方法，该引物组能够有效扩增出特异性片段，根据这些片段能够有效鉴别罗氏沼虾的性别，甚至能够区分雄性、雌性和超雌性基因型，为其杂交育种和基因分型提供了帮助。
附图说明
[0022]
图1为本技术实施例提供的罗氏沼虾性腺组织he染色图。
[0023]
图2为本技术实施例提供的罗氏沼虾性腺组织提取dna的电泳图，第一泳道为marker，其他为来自不同罗氏沼虾个体的提取dna样本。
[0024]
图3为本技术实施例提供的第一引物对对罗氏沼虾雌雄个体的pcr扩增产物的电泳结果。
[0025]
图4为本技术实施例提供的第二引物对对罗氏沼虾雌雄个体的pcr扩增产物的电泳结果。
[0026]
图5为本技术实施例提供的(a)第二引物对扩增超雌虾、正常雌虾和雄虾dna qpcr的定量结果和(b)第三引物对扩增超雌虾、正常雌虾和雄虾dna qpcr的定量结果。
具体实施方式
[0027]
为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。下述实施例涉及的试剂或仪器，若无特殊说明，均可从商业涂胶获得；实验方法如无特别说明，均为常规方法。
[0028]
1、罗氏沼虾以及组织材料
[0029]
罗氏沼虾雌性各8只，购买于果园农贸市场，取其肌肉组织立即用液氮冷冻，放置
‑
80℃冰箱储存备用。
[0030]
罗氏沼虾雌雄性表型鉴定：采取罗氏沼虾性腺组织，进行包埋、切片、常规he染色后，在显微镜下观察性腺切片确定雌雄，如图1所示，a为；雌性的卵巢切片，b为雄性的精巢切片。
[0031]
2、dna的提取：
[0032]
1)取大约0.2g冷冻的肌肉组织放入1.5ml的ep管中，用消毒过的剪刀将肌肉剪碎，放入600μl的裂解缓冲液，放入55℃水浴消化至肌肉完全溶解，期间上下颠倒数次。
[0033]
2)待消化液冷却至室温后，每管加入2μlrnanase(10mg/ml)，37℃消化30min。
[0034]
3)加入等体积的饱和酚溶液，上下颠倒摇匀15min后，4℃，12000rpm离心15min。
[0035]
4)吸取上清到新的ep管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒摇匀15min后，4℃，12000rpm离心15min。
[0036]
5)吸取上清到新的ep管中，加等体积氯仿：异戊醇(24:1)，上下颠倒摇匀15min后，4℃，12000rpm离心5min。
[0037]
6)吸取上清到新的ep管中，加入二倍体积预冷的无水乙醇到上清液中。上下颠倒旋转离心管，沉淀dna后。4℃，12,000转，离心10min
[0038]
7)弃上清，加1ml 70％的无水乙醇洗涤沉淀后，4℃，8000rpm离心10min。
[0039]
8)吸去乙醇，打开盖子，室温放置干燥10min，加50μl无酶水溶解沉淀
[0040]
提取的dna在1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，并用酶标仪检测其a260/280值在1.8～2.0之间。选择dna完整性良好的进行后续实验，例如图2中所示dna。
[0041]
2、第一引物对
[0042]
本技术进一步对上述提取得到的dna片段进行测序，挑取其中与性别相关联的片段作为靶序列，再根据靶序列设计第一引物对。
[0043]
靶序列的核苷酸序列如seq id no.7所示，第一引物对的核苷酸序列为如seq id no.1～2所示，均由上海生工公司提供。
[0044]
3、利用第一引物对进行pcr扩增
[0045]
以上述提取得到的16只罗氏沼虾得到的dna片段(约100ng/μl)作为扩增模板，进行pcr扩增。
[0046]
扩增体系共20μl：mix 10μl，f引物0.25μl，r引物0.25μl，模板1μl和ddh2o 8.5μl。
[0047]
扩增程序为：95℃ 5min
→
95℃ 30s
→
60℃ 30s；30个循环；
→
72℃ 30s
→
72℃ 10min。
[0048]
扩增结果如图3所示。8个雌性个体dna扩增结果有两条带，8个雄性个体dna扩增结果仅有一条带，因此，根据第一引物对，对罗氏沼虾肌肉组织进行pcr扩增，电泳检测扩增产
物，根据条带数量即可实现对罗氏沼虾性别的鉴定。
[0049]
4、扩增条带测序
[0050]
上述实施例的结果中，分子量较大的条带为雌雄性共有条带，另外分子量较小条带为雌性特异条带。将雌性特异性条带的dna序列命名为第一序列，将雌雄性共用条带的dna序列命名为第二序列，将3条序列进行测序和多重比对发现，第一序列(如seq id no.8所示)与第二序列(seq id no.9所示)的同源性为83.42％。
[0051]
5、针对第一序列和第二序列的特异性引物
[0052]
根据上述比对结果发现的第一序列和第二序列的差异，分别设计针对第一序列的第二引物对和针对第二序列的第三引物对，第二引物对的核苷酸序列如如seq id no.3～4所示，第三引物对的核苷酸序列如seq id no.5～6所示。第二引物对和第三引物对均由上海生工公司提供。
[0053]
实验材料：购自菜市场的健康的16只性成熟雌性罗氏沼虾和16只雄性罗氏沼虾，来自中国、越南和孟加拉国的当地渔业市场，83只超级雌性来自扬州的一个养殖农场(从以色列进口)。其中，将促雄腺移植到雌性个体，可以使雌性性反转为雄性，此类个体再与正常的雌性交配，可产生雌雄比例为3:1的后代，该后代即包含超雌性个体。
[0054]
采用上述相同方法提取罗氏沼虾的肌肉组织的基因组dna，以及相同的pcr扩增方法进行扩增，利用第二引物对对16只雌性个体和16只雄性个体进行种群验证。结果如图4所示，在16个雌性个体中均可扩增出一条长119bp的条带，而雄性个体均未扩增出条带。由此说明本技术实施例提供的第二引物对具有针对第一序列的特异性，而不能扩增第二序列。并且，利用第二引物对进行pcr扩增，电泳检测，根据电泳条带亦能判别罗氏沼虾的性别。
[0055]
同样利用第二引物对或第三引物对对上述的超雌性个体、雌性个体和雄性个体进行qpcr扩增，根据qpcr对扩增产物的定量结果，亦能够判别罗氏沼虾的性别。具体过程如下：
[0056]
采用上述相同的方法提取具有组dna上述实验材料的dna。然后，用qpcr对特别扩增染色体片段的引物进行检测，以确定超雌性个体、雌性个体和雄性个体之间的剂量差异。
[0057]
qpcr反应体系(20μl)含有10μl的syrbgreen(takara)，1μl的dna模板，上下游引物各0.25μl，8.5μl的水。pcr循环参数如下：95℃ 3min
→
95℃ 30s(40个循环)
→
60℃ 30s
→
72℃ 30s
→
72℃延伸10min，以β
‑
actin的引物作为内对照。采用2
－
△△
ct
法计算相对表达水平，每个样本重复运行三次。
[0058]
结果如图5所示。如图5a所示，第二引物对扩增的结果可知，其中相对表达量多的为超雌性个体，表达量少的为正常雌性个体，并且超雌虾个体是正常雌虾个体的相对表达量的二倍关系；而无表达量为雄性个体。
[0059]
同样地，如图5b所示，第三引物对扩增的结果可知，其中相对表达量较多的为雄性个体，表达量少的为正常雌性个体，并二者相对表达量也具有二倍剂量关系；而无表达量的为超雌性个体。由此说明，而通过第三引物对扩增亦能实现罗氏沼虾的性别鉴定。
[0060]
由此说明，利用本技术实施例公开的第二引物对区分超雌虾和正常雌虾，利用第三引物对能够区分雌虾和雄虾，并且还能其相对表达量，为罗氏沼虾的性别鉴定提供了全新的方法。
[0061]
综上所述，本技术实施例通过引物组能够扩增出有关罗氏沼虾性染色体的特异性
片段，不仅能够鉴别罗氏沼虾性别，为获得其全雄性个体育种提供帮助；还能够通过这些特异性引物，准确鉴别雌性和超雌性罗氏沼虾个体，这为其杂交育种和基因分型研究提供帮助。
[0062]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。