酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法

1.本发明涉及香料合成技术领域，特别是涉及一种酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法。


背景技术：

2.芳香族酮类香料化合物是一种重要的芳香族类香料化合物，在香料化合物中占比大，其在食品、化妆品、医药和日化产品的合成领域有着广泛的应用，因而开发芳香族酮香料化合物的合成方法一直受到广大研究人员的关注。目前，芳香族酮香料化合物主要是通过化学法来制备，比如芳香烃的friedel-craft酰基化反应、缩合反应偶联催化加氢还原反应、过渡金属催化的交叉偶联酰基化反应等。尽管已经有多种芳香族酮香料化合物的合成方法被公开，然而这些方法在反应过程中或需要使用强酸强碱或重金属离子作为催化剂，或需要高温反应条件。同时，美国和欧洲的法律规定，“天然”香料只能用物理过程从天然原料中萃取，或用酶/微生物工艺制备。
[0003]“芳香族酮类香料化合物的酶法生物合成研究”是食品科学研究热点前沿领域之一。与化学法相比，酶法不仅具有安全、催化高效、环境友好等特点，且是一些结构复杂的手性芳香族酮类化合物的唯一有效制备技术手段。因此，开发芳香族酮类香料化合物的酶法生物合成的关键技术，不仅迫在眉睫，且其科学意义与国家行业发展战略意义重大。
[0004]
非特异性过氧合酶(unspecific peroxygenase，upo)是一类来源于真菌的氧化酶，upo被认为是非活化c-h键选择性氧官能化的“梦想催化剂”。可催化多种氧化反应，例如磺化反应、环氧化反应、羟基化反应、脱烷基化反应、有机杂原子和无机卤化物的氧化反应等，与具有催化惰性c-h键氧化活性的p450单加氧酶不同，upo催化无需以昂贵的nad(p)h作为电子来源，仅需利用h2o2作为氧供体，且upo的催化氧化反应的副产物仅为水。


技术实现要素：

[0005]
基于此，本发明的提供了一种新的酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法，该方法将非特异性过氧合酶与胆碱氧化酶相结合协同氧化芳香仲醇，可以得到一系列不同种类的芳香族酮类香料化合物。
[0006]
本发明包括如下技术方案。
[0007]
一种酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法，包括如下步骤：
[0008]
在氯化胆碱的存在下，芳香仲醇在非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶的共同催化下进行氧化反应，即得所述芳香族酮类香料化合物。
[0009]
在其中一些实施例中，所述芳香仲醇具有如下式(i)所示结构，所述芳香族酮类香料化合物具有如下式(ii)所示结构：
[0010][0011]
其中，r选自：羟基、烷基、烷氧基；
[0012]
r1选自：烷基、苯基；
[0013]
x选自：亚烷基、烯基；
[0014]
n为0，或者大于0的整数；
[0015]
m选自：0、1、2、3、4、5。
[0016]
在其中一些实施例中，r选自：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基。
[0017]
在其中一些实施例中，r选自：甲基、甲氧基；m选自：0、1。
[0018]
在其中一些实施例中，r1为c
1-c6烷基。
[0019]
在其中一些实施例中，r1为甲基。
[0020]
在其中一些实施例中，x选自：c
1-c6亚烷基。
[0021]
在其中一些实施例中，x为亚甲基，n选自：0、1、2、3。
[0022]
在其中一些实施例中，所述芳香仲醇选自如下化合物：
[0023][0024]
所述芳香族酮类香料化合物对应选自如下化合物：所述芳香族酮类香料化合物对应选自如下化合物：
[0025]
在其中一些实施例中，所述非特异性过氧合酶为来源于茶树菇的aaeupo，所述胆碱氧化酶为来源于烟酸节杆菌的anchox。
[0026]
在其中一些实施例中，所述酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法包括如下步骤：在反应瓶中添加缓冲溶液、芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶，搅拌反应，每隔10小时-14小时补加所述非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶，反应20小时-36小时，即得所述芳香族酮类香料化合物。
[0027]
在其中一些实施例中，首次添加时，所述芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶
和胆碱氧化酶的添加量之比为20mmol/l-50mmol/l：0.15mol/l-0.25mol/l：0.5μmol/l-2μmol/l：2.5μmol/l-10μmol/l；补加所述非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶时，每次补加的量与首次添加的量相同。
[0028]
在其中一些实施例中，首次添加时，所述芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶的添加量之比为25mmol/l：0.2mol/l：0.5μmol/l-2μmol/l：2.5μmol/l-10μmol/l。
[0029]
在其中一些实施例中，首次添加时，所述芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶的添加量之比为25mmol/l：0.2mol/l：0.8μmol/l-1.5μmol/l：2.5μmol/l-7.5μmol/l。
[0030]
在其中一些实施例中，首次添加时，所述芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶的添加量之比为25mmol/l：0.2mol/l：1μmol/l：2μmol/l-5μmol/l。
[0031]
在其中一些实施例中，首次添加时，所述芳香仲醇、氯化胆碱、非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶的添加量之比为25mmol/l：0.2mol/l：1μmol/l：2.5μmol/l。
[0032]
在其中一些实施例中，所述反应的温度为5℃-50℃。
[0033]
在其中一些实施例中，所述反应的温度为20℃-40℃。
[0034]
在其中一些实施例中，所述反应的温度为28℃-35℃。
[0035]
在其中一些实施例中，所述反应的温度为30℃-31℃。
[0036]
在其中一些实施例中，所述反应的ph为6-9。
[0037]
在其中一些实施例中，所述反应的ph为7-9。
[0038]
在其中一些实施例中，所述反应的ph为8-9。
[0039]
在其中一些实施例中，所述反应的ph为8-8.5。
[0040]
在其中一些实施例中，所述反应的ph为8。
[0041]
在其中一些实施例中，所述反应的时间为24小时-36小时，每隔12小时补加所述非特异性过氧合酶和胆碱氧化酶。
[0042]
本发明的发明人发现非特异性过氧合酶也可以用于将芳香仲醇氧化成芳香酮，但是，非特异性过氧合酶的催化氧化反应需要利用h2o2作为氧供体，如果直接在反应体系中添加h2o2，会导致体系中过氧化氢的局部浓度偏高，从而会损伤非特异性过氧合酶的酶活性，导致底物的转化率低，芳香酮的产率低。并且，h2o2需要分批多次添加，1-2个小时即需要补添加一次，操作非常繁琐，且频繁打开反应容器的盖子，底物和产物容易挥发，从而会进一步降低底物的转化率和产物得率。胆碱氧化酶(choline oxidase，chox)是一类黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)氧化酶，属于葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(gmc)超家族，能够以o2为最终电子受体催化氧化氯化胆碱为甘氨酸甜菜碱，同时生成h2o2。本发明的发明人进一步研究发现：将来源于茶树菇的非特异性过氧合酶(aaeupo)与来源于烟酸节杆菌的胆碱氧化酶(anchox)通过级联工艺设计，可进行芳香族酮类香料化合物的制备。利用胆碱氧化酶(anchox)对氯化胆碱进行催化氧化产生的h2o2，非特异性过氧合酶(aaeupo)对底物芳香族仲醇类化合物进行催化氧化，即可得到一系列芳香族酮类香料化合物。
[0043]
本发明首次将“aaeupo偶联anchox”级联催化反应应用于制备芳香族酮类香料化合物，胆碱氧化酶(anchox)可利用氯化胆碱原位产生h2o2，以供过氧合酶(aaeupo)催化氧化底物的需要。在线原位产生h2o2可避免多次分批添加h2o2的繁琐操作，同时可以有效防止反
应体系中h2o2浓度过高对酶活性中心造成损伤而影响催化效果，将这两种酶配合使用具有协同增效的作用，大大提高了酶催化效果，提高了底物转化率和产物酮的收率。通过对反应条件的进一步优化，底物转化率可达68％左右。
[0044]
本发明的酶法合成芳香族酮类香料化合物的方法既能利用氯化胆碱原位产生h2o2，维持体系中h2o2浓度在可高效催化且不破坏酶活性的稳定水平；同时拓宽了upo的催化应用范围，合成了一系列高价值的芳香族酮类香料化合物。本发明方法的反应条件温和，操作简单，且无需使用大量有毒有害有机试剂，副产物仅仅为水，绿色环保，为芳香族酮类香料的合成提供了一条全新的生物酶级联催化路径。
附图说明
[0045]
图1为本发明生物酶法级联催化合成芳香酮示意图。
[0046]
图2为双酶级联催化效果测试。
[0047]
图3为aaeupo h2o2(直接添加h2o2)与双酶级联(在线产h2o2)催化效果对比实验。
[0048]
图4为不同aaeupo酶加量催化4-苯基-2-丁醇反应12h的气相色谱图。
[0049]
图5为aaeupo酶加量对芳香族仲醇的氧化效果的影响，其中，(a)为产物浓度；(b)为转化率。
[0050]
图6为不同anchox酶加量催化4-苯基-2-丁醇反应12h的气相色谱图。
[0051]
图7为anchox酶加量对芳香族仲醇的氧化效果的影响，其中，(a)为产物浓度；(b)为转化率。
[0052]
图8为酶的协同催化过程研究，其中(a)的底物浓度为50mm，(b)的底物浓度为25mm。
[0053]
图9为anchox的温度稳定性分析。
[0054]
图10为h2o2对anchox酶活力的影响。
[0055]
图11为anchox酶加量优化探究。
[0056]
图12为ph对芳香族仲醇氧化的影响。
[0057]
图13为温度对芳香族仲醇氧化的影响。
[0058]
图14为不同底物氧化的气相色谱图。
具体实施方式
[0059]
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0060]
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
[0061]
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
[0062]
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关
系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
[0063]
以下为具体实施例。
[0064]
本发明各实施例中所用的试剂均购自sigma-aldrich、麦克林或阿拉丁公司，无需进一步提纯即可直接使用。
[0065]
实施例1：双酶级联催化效果测试
[0066][0067]
以实验序号4为例，实验步骤如下：在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(终浓度为1μm)，anchox酶液(终浓度为5μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为50mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶置于恒温油浴锅，30℃、500rpm条件下反应24h，反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测。
[0068]
产物检测方法：反应后产物酮的含量由安捷伦7890b气相色谱仪进行检测，采用各物质标准品进行气相色谱出峰时间定性(4-苯基-2-丁醇和苄基丙酮的保留时间分别为17.5和16.0)，并采用上述标准品配制不同浓度的标准溶液，正十二烷做内标，通过气相检测制作标准曲线，用于定量分析。色谱分析柱为kb-ffap(30m*0.25mm*0.25μm)，升温程序为：初始温度60℃，以80℃/min升到120℃，保留6min，再以20℃/min升到230℃，保留8min。
[0069]
结果如图2所示：在anchox或者aaeupo单独存在的情况下，均未观察到产物酮的生成；但是在两者同时存在的情况下，观察到明显的产物酮生成，说明只有双酶级联才能有效催化氧化仲醇底物得到相应的酮产物。
[0070]
实施例2 aaeupo h2o2(直接添加h2o2)与双酶级联(在线产h2o2)
[0071]
催化效果对比实验
[0072]
双酶级联催化反应操作步骤同实施例1。
[0073]
aaeupo h2o2催化反应实验操作步骤：在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，aaeupo酶液(终浓度为1.0μm)，加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为50mm，底物预先溶于乙腈中)，最后加入h2o2(浓度为2mm)。将反应瓶置于恒温油浴锅，30℃、500rpm条件下进行反应，期间每2h添加一次h2o2(浓度为2mm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1)。
[0074]
结果如图3所示：在反应持续进行的12h内，级联催化反应体系(在线产h2o2)生成的产物苄基丙酮浓度均显著高于单酶催化反应体系(直接添加h2o2)。
[0075]
实施例3：aaeupo酶加量对芳香族仲醇氧化的影响
[0076][0077]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(终浓度分别为0.5μm、1.0μm、1.5μm和2.0μm)，anchox酶液(终浓度为5μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为50mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶置于恒温油浴锅，30℃、500rpm条件下进行反应，反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1，气相色谱图如图4所示)。
[0078]
结果如图5所示：底物在upo酶加量为1μm的情况下反应12h，产物浓度达到12mm，底物转化率为24％，反应基本可以达到平衡状态。
[0079]
实施例4：anchox酶加量对芳香族仲醇氧化的影响
[0080][0081]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(终浓度为1.0μm)，anchox酶液(终浓度分别为2.5、5.0、7.5和10.0μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为50mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶置于恒温油浴锅，30℃、500rpm条件下进行反应，反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1，气相色谱图如图6所示)。
[0082]
结果如图7所示：底物在chox酶加量为5μm的情况下反应12h，产物浓度达到11mm，底物转化率为22％，反应基本可以达到平衡状态。
[0083]
实施例5：酶的协同催化过程研究
[0084][0085]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(初始浓度为1.0μm)，anchox酶液(初始浓度为5.0μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度分别为25、50mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶放在圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，于反应温度为30℃条件下反应48h，期间每12h补加一次aaeupo酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为4.0μm)或anchox酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为20.0μm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1)。
[0086]
结果如图8所示：相较于aaeupo而言，anchox对级联催化反应效果的影响起主要作用，也即anchox是整个反应的关键限制因素。底物浓度为25mm，反应时间为24h的情况下，转化率高达54.11％。
[0087]
实施例6：anchox的温度稳定性分析
[0088]
反应条件：在4ml的透明玻璃反应瓶中加入等体积的磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)和anchox酶液,反应的总体积为3ml。将反应瓶放在圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，于反应温度为30℃、搅拌速度为500rpm条件下孵育6和12h。分别测定孵育前后anchox的酶活力，初始酶液样品的酶活定义为100％，具体酶活力测定方法如下所示：
[0089]
通过测定anchox催化氯化胆碱反应生成过氧化氢(h2o2)的量来分析其活性。具体操作如下：在反应瓶中加入2450μl磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)、250μlanchox酶液和300μl氯化胆碱溶液(终浓度为100mm)，在25℃下反应30min，测定反应体系中h2o2浓度。每组实验设置三组平行，以缓冲液代替酶液作为空白对照，其他操作条件相同。酶活力定义为：在25℃条件下，单位时间内(min)催化氯化胆碱生成1μmol h2o2所需的酶量为一个活力单位(u)。
[0090]
h2o2浓度检测方法：辣根过氧化物酶(hrp)利用h2o2催化abts氧化成绿色的氧化态abts，后者在420nm处具有特征吸光度。通过酶标仪测定相应吸光度值，制作不同浓度h2o2的标准曲线，计算待测液的h2o2浓度。
[0091]
h2o2浓度检测反应体系
[0092][0093]
结果如图9所示：在30℃孵育12h后，anchox仍能维持95％左右的酶活力，表明并不是由于anchox的温度稳定性太差而在反应过程中失活，从而影响级联催化效果。
[0094]
实施例7：h2o2浓度对anchox酶活力的影响
[0095]
反应条件：在anchox酶液中分别加入不同浓度的h2o2，使h2o2在体系中终浓度分别为2、5、10和15mm，将样品置于4℃冰箱分别孵育1、2、4、8、12h后检测其酶活力(检测方法同实施例6)。
[0096]
结果如图10所示：体系中h2o2浓度为15mm时，anchox酶活迅速下降，孵育2h后，基本已经观察不到酶活力。可知当体系中h2o2浓度到达一定值时，anchox的活性会受到较大影响甚至可能直接失活，因此，需要优化anchox酶加量防止其产生过多h2o2而影响级联催化效果。
[0097]
实施例8：anchox酶加量优化探究
[0098]
[0099]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 7.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(终浓度为1.0μm)，anchox酶液(初始浓度分别为1.5μm、2.5μm、5.0μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为25mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶放在自置圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，于反应温度为30℃条件下反应36h，期每12h补加一次anchox酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度分别为4.5μm、7.5μm、15.0μm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1)。
[0100]
结果如图11所示：反应24h时，anchox浓度从1.5μm增加到2.5μm，转化率从46.7％升高到56.5％，随着anchox浓度进一步增加到5.0μm，转化率却有所下降。可能原因是反应过程中补加浓度为5.0μm的anchox后，体系中产生的h2o2积累过多未能被aaeupo充分消耗，从而对anchox自身的活性以及aaeupo的活性产生了影响。
[0101]
实施例9：ph对氧化效果的影响
[0102][0103]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(初始浓度为1.0μm)，anchox酶液(初始浓度为2.5μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为25mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶放在自置圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，于反应温度为30℃条件下反应24h，期间每12h补加一次aaeupo酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为2.0μm)和anchox酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为5.0μm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1)。
[0104]
结果如图12所示：ph为8.0的条件下，级联催化效果最好，转化率最高可达到67.2％。
[0105]
实施例10：温度对氧化效果的影响
[0106][0107]
在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 8.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(初始浓度为1.0μm)，anchox酶液(初始浓度为2.5μm)，最后加入底物4-苯基-2-丁醇(终浓度为25mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶放在圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，分别于反应温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃和50℃条件下反应24h，期间每12h补加一次aaeupo酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为2.0μm)和anchox酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为5.0μm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1)。
[0108]
结果如图13所示：在反应温度为30℃的条件下，双酶级联催化生成芳香酮的产物浓度最高达到16.9mm，底物转化率为67.63％。
[0109]
实施例11：底物拓展
[0110][0111]
以1-苯基乙醇、二苯甲基、1-(4-甲基苯基)乙醇、4-苯基-2-丁醇、4-甲氧基-α-甲基苯甲醇等为底物，在4ml的透明玻璃反应瓶中依次加入磷酸盐缓冲溶液(50mm,ph 8.0)，chcl(终浓度为0.2m)，aaeupo酶液(初始浓度为1.0μm)，anchox酶液(初始浓度为2.5μm)，最后加入底物(终浓度为25mm，底物预先溶于乙腈中)，反应的总体积为1ml。将反应瓶放在圆孔反应架，然后整体置于恒温油浴锅中，于反应温度为30℃条件下反应24h，期间每12h补加一次aaeupo酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为2.0μm)和anchox酶液(每次补加的量与首次添加的量相同，终浓度为5.0μm)。反应结束后用含有25mm正十二烷内标的乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，12000rpm离心3min后，取上层有机相进行气相检测(检测方法同实施例1，气相色谱图如图14所示)。
[0112]
各底物和产物的气相定性结果如下表1所示：
[0113]
芳香族仲醇/芳香酮的气相色谱保留时间
[0114]
[0115][0116]
反应结果如下表2所示：利用本发明的方法和反应条件，可合成不同种类的芳香族酮类香料化合物(转化率分别在7.98-67.89％之间)。
[0117]
表2.底物拓展
[0118][0119]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0120]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求书为准。