一种截短的马铃薯糖蛋白Patatin及其制备方法与流程

一种截短的马铃薯糖蛋白patatin及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及一种截短的马铃薯糖蛋白patatin及其制备方法，属于生物工程领域。


背景技术：

2.世界人口快速增长，对食物蛋白质的需求不断增加，这给粮食安全带来了挑战。近年来，人们开始从植物、藻类和昆虫中寻找新的、可替代的和可持续的蛋白质来源。其中一种备受关注的植物蛋白便是马铃薯蛋白，而马铃薯块茎蛋白patatin是马铃薯蛋白的主要组成部分。与其他蛋白质一样，马铃薯patatin除了具有营养价值外，还具有优异的凝胶性、起泡性、酯酰基水解活性和抗氧化活性等功能特性。creusot等的研究发现，patatin和β
‑
乳球蛋白、卵清蛋白及大豆蛋白的流变性能高度相似，但其起始凝胶温度和成胶时所需的离子强度都显著低于其他三种常见的凝胶蛋白，而且patatin成胶时具有形变小的流变特性。patatin具有独特的热聚合和成胶特性，将会成为一种优异的食品胶凝剂。
3.在我国，马铃薯主要用于生产淀粉，这一过程中产生的大量废液称为马铃薯汁(potato fruit juice，pfj)。据统计，1000kg马铃薯生产淀粉的过程可以产生5～12m3的废液，其中含有质量分数1％～2％的马铃薯蛋白质。目前，已有较多从pfj中提取马铃薯蛋白的物理及化学方法，如na2so3水溶液浸提法、热聚合法、酸沉淀法和膜回收法。各种提取方法各具优缺点，但未能同时做到蛋白无毒安全、高回收率、低成本、保持蛋白功能特性。由于工业生产过程中，难以避免会有大量已经发芽的马铃薯会被混入加工原料中，其中的龙葵素等毒素会与蛋白结合，从而影响马铃薯分离蛋白的食用安全性。近年，马铃薯patatin通过基因工程手段在大肠杆菌已得到表达，但是大肠杆菌表达常出现包涵体，而且安全性无法保证，难以应用于食品工业中。
4.毕赤酵母是目前应用非常广泛的异源蛋白表达宿主菌株，其易于培养，生长迅速，外源基因表达量高，安全无毒性，且具有翻译后加工修饰系统，可以对真核来源的基因进行正确的翻译后加工，并能有效地将外源基因表达产物分泌到细胞外，所以考虑将毕赤酵母作为马铃薯patatin的合成宿主菌。此外，选用其他具有一定食品安全特性的微生物表达宿主，也会对马铃薯patatin的生产与应用起到很好的促进作用。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种糖蛋白patatin
‑
1突变体，具有如seq id no.2～5任一所示的氨基酸序列。
6.在一种实施方式中，所述糖蛋白patatin
‑
1突变体是在seq id no.1所示的马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1的基础上，分别截短了第2～23位、2～37位、2～60位、2～71位氨基酸序列。
7.在一种实施方式中，所述糖蛋白patatin
‑
1突变体是在seq id no.1所示的马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1的基础上，截短了第2～23位氨基酸，得到seq id no.2所示的氨基酸序列。
8.在一种实施方式中，所述糖蛋白patatin
‑
1突变体是在seq id no.1所示的马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1的基础上，截短了第2～37位氨基酸，得到seq id no.3所示的氨基酸序列。
9.在一种实施方式中，所述糖蛋白patatin
‑
1突变体是在seq id no.1所示的马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1的基础上，截短了第2～60位氨基酸，得到seq id no.4所示的氨基酸序列。
10.在一种实施方式中，所述糖蛋白patatin
‑
1突变体是在seq id no.1所示的马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1的基础上，截短了第2～71位氨基酸，得到seq id no.5所示的氨基酸序列。
11.本发明还提供了编码上述糖蛋白patatin
‑
1突变体的基因。
12.在一种实施方式中，所述基因含有seq id no.7所示的核苷酸序列。
13.本发明还提供含有上述基因的表达载体。
14.在一种实施方式中，所述表达载体是将seq id no.7所示的基因连接至ppic9k质粒上snabi和avrii位点之间。
15.在一种实施方式中，所述表达载体还包括pxw55质粒或pklac1质粒。
16.本发明还提供表达所述糖蛋白patatin
‑
1突变体的重组菌株。
17.在一种实施方式中，所述重组菌株的宿主细胞包括但不限于毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母。
18.在一种实施方式中，所述重组菌株是以毕赤酵母gs115为宿主，以ppic9k质粒为表达载体，表达seq id no.7所示的编码糖蛋白突变体的基因。
19.在一种实施方式中，所述重组菌株是以酿酒酵母bj5464为宿主，以pxw55质粒为表达载体，表达seq id no.7所示的编码糖蛋白突变体的基因。
20.在一种实施方式中，所述重组菌株是以乳酸克鲁维酵母gg799为宿主，以pklac1质粒为表达载体，表达seq id no.7所示的编码糖蛋白突变体的基因。
21.本发明还提供一种提高酵母细胞中糖蛋白patatin
‑
1合成量的方法，所述方法是对马铃薯来源的patatin
‑
1进行n端的氨基酸截短，在酵母细胞中表达截短了的糖蛋白patatin
‑
1。
22.在一种实施方式中，所述截短是指截去n端第一位甲硫氨酸之后的22、36、59或70个氨基酸。
23.本发明还提供一种合成糖蛋白patatin
‑
1的方法，所述方法是将所述的重组菌株在培养基中，于28～32℃，200～250rpm发酵至少96h。
24.本发明还提供所述重组菌株在制备糖蛋白patatin或含有糖蛋白patatin的产品中的应用。
25.本发明的有益效果：
26.本发明提供了氨基酸序列如seq id no.2～5所示的糖蛋白patatin
‑
1，是在seq id no.1所示糖蛋白的基础上截短了n端第2～23位、2～37位、2～60位或2～71位氨基酸。将截短的糖蛋白以重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑
1为载体在毕赤酵母gs115中表达；或分别以酿酒酵母bj5464、乳酸克鲁维酵母gg799为宿主，以带有his标签的重组质粒表达截短的糖蛋白，再用镍离子亲和层析柱纯化，可获取目标蛋白patatin
‑
1。本发明提供的策略为糖蛋白
patatin的应用奠定了基础。
附图说明
27.图1：ppic9k
‑
patatin
‑
1质粒图谱。
28.图2：重组截短的马铃薯糖蛋白patatin
‑
1毕赤酵母表达结果。
具体实施方式
29.(一)培养基
30.lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l。加入20g/l琼脂粉，以配制lb固体培养基。
31.ypd培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l。加入20g/l琼脂粉，以配制ypd固体培养基。
32.md培养基：去离子水798ml/l，加入20g/l琼脂粉；倒板前加入体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，葡萄糖20g/l，以配制md固体培养基。
33.bmgy培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，甘油20g/l，50mmol/l的磷酸钾缓冲溶液，体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，生物素4
×
10
‑4g/l。
34.bmmy培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，甲醇10g/l，50mmol/l的磷酸钾缓冲溶液，体积分数10％的10
×
ynb酵母基础氮源母液，生物素4
×
10
‑4g/l。
35.实施例1重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑
1以及含截短糖蛋白基因的重组质粒的构建
36.(1)构建重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑137.来源于solanum chacoense的patatin storage protein具有合成糖蛋白patatin的能力，合成核苷酸序列如seq id no.6所示的编码糖蛋白patatin的基因，将其连接至ppic9k质粒上snabi和avrii两个位点之间，命名为ppic9k
‑
patatin
‑
1，由苏州金唯智公司合成。
38.(2)构建突变质粒
39.以步骤(1)构建的重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑
1为模板，所用引物序列见表1，分别构建糖蛋白patatin
‑
1的n端截短22个(第2～23位氨基酸)、36个(第2～37位氨基酸)、59个(第2～60位氨基酸)和70个(第2～71位)氨基酸的突变质粒：ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t22、ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t36、ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t59和ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t70。每一截短序列分别对应一个或若干个α
‑
螺旋或者β
‑
折叠。以patatin
‑1‑
t22为例，以t22
‑
f/t22
‑
r为引物，以ppic9k
‑
patatin
‑
1为模板，扩增含22个氨基酸阶段的patatin
‑
1片段的重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t22。
40.pcr反应体系：pcr总体系为50μl，其中包括25μl的高保真dna聚合酶：
[0041]2×
phanta max master mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)、20μl超纯水、上游和下游引物各2μl、1μl模板。
[0042]
pcr反应条件：预变性：95℃，3min、反应步骤包括：(1)变性：95℃，15s、(2)退火：55～60℃，15s、(3)延伸：72℃，1～5min，设置25～32个循环数。最后延伸阶段：72℃，5～10min。
[0043]
pcr产物经过1％
‑
2％琼脂糖凝胶电泳验证后，在pcr产物中加入dpnⅰ酶，并在37℃孵育1～2h以消除环形质粒模板；随后对pcr产物进行纯化回收，使用gibson组装的方法将线性化的质粒组转为环形质粒，组装后的质粒转入大肠杆菌jm109感受态中，涂布于加有相应抗生素的lb固体培养基中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆并提取质粒，测序正确后，留作重组毕赤酵母构建使用。
[0044]
表1构建截短马铃薯糖蛋白patatin
‑
1表达载体所用引物
[0045][0046]
实施例2重组截短的糖蛋白patatin
‑
1表达毕赤酵母构建
[0047]
将实施例1中测序正确的重组质粒ppic9k
‑
patatin
‑
1以及突变质粒ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t22、ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t36、ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t59和ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t70质粒使用salⅰ酶在37℃孵育1h进行质粒线性化处理，分别通过毕赤酵母电击转化转入毕赤酵母gs115感受态细胞中，涂布于md固体平板上，30℃培养2
‑
3天，挑取阳性克隆，构建重组毕赤酵母gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑
1、gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t22、gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t36、gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t59和gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑1‑
t70。
[0048]
将重组毕赤酵母进行摇瓶发酵，具体方法如下：
[0049]
1)接种ypd平板活化的毕赤酵母gs115于25ml/250ml三角瓶，30℃过夜培养；1％接种上述培养液于50ml/500ml三角瓶，培养菌体浓度od
600
为1.3～1.5；
[0050]
2)5000r/min，4℃离心10min收集菌体，分别用50ml、25ml无菌水悬浮细胞；
[0051]
3)使用5ml 1m d
‑
山梨醇溶液悬浮上述细胞，5000r/min，4℃离心10min收集菌体；
[0052]
4)使用500μl 1m d
‑
山梨醇溶液悬浮上述细胞，分装80μl/1.5ml ep管用于电击转化感受态细胞；
[0053]
5)20μl线性化质粒与上述80μl感受态细胞混合，冰上静置15min；
[0054]
6)上述混合物加入预冷的无菌电转化杯(0.2cm)，1500v、25f、200q电击一次，加入1ml 1m d
‑
山梨醇溶液；
[0055]
7)取上述混合物150u l涂布md固体平板，30℃培养2～3天；
[0056]
8)挑取上述平板中白色菌落，筛选正确的转化子。分别点种在1、2、3、4mg/ml(g418遗传霉素)ypd平板中，挑选在4mg/mlg418遗传霉素平板中的单菌落用于250ml摇瓶发酵。
[0057]
实施例3重组毕赤酵母摇瓶发酵
[0058]
挑取实施例2筛选的在4mg/ml g418遗传霉素平板生长的高拷贝转化子，接种于含
有50ml ypd的250ml三角瓶中，30℃培养1
‑
2天。
[0059]
取500μl ypd菌种活化液加入到50ml bmgy培养基中，30℃培养15～16h。菌液离心，使用生理盐水洗涤菌体，去上清后收集菌体加入50ml bmmy培养基中重悬，30℃摇床培养。接种后每隔24h取样一次，加入1％甲醇。
[0060]
表达截短22个氨基酸的糖蛋白的重组酿酒酵母a22发酵96h的产量可达157mg/l以上。截短不同氨基酸个数的重组酵母酵母发酵120h的结果如图2所示。表达第2～23位氨基酸截短的糖蛋白(a22)的重组毕赤酵母，相对于表达完整糖蛋白的重组毕赤酵母gs115
‑
ppic9k
‑
patatin
‑
1(15mg/l)，patatin产量提高了1500％，可达225mg/l。对g36、n59和d70这三个氨基酸位点截短后的重组毕赤酵母，没有检测到有patatin的生成。可见，对第2～23位氨基酸截短对毕赤酵母合成patatin的效果更优。
[0061]
实施例4马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1纯化
[0062]
离心收集实施例3的发酵后的上清液，根据操作说明，使用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白。缓冲液a：20mm咪唑，300mm nacl，50mm nah2po4，洗脱液b为上样缓冲液a中咪唑浓度调整为500mm。使用脱盐柱脱盐，脱盐缓冲液为ph7.4的tris
‑
hcl缓冲液，检测纯化的糖蛋白patatin
‑
1、patatin
‑1‑
t22、patatin
‑1‑
t36、patatin
‑1‑
t59和patatin
‑1‑
t70含量。
[0063]
实施例5马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1在酿酒酵母中的表达
[0064]
按照实施例1～3相同的策略构建含糖蛋白patatin
‑
1编码基因的pxw55质粒，并将构建的重组质粒分别在酿酒酵母bj5464中表达。将重组酿酒酵母在ynb培养基中培养一段时间，可检测到patatin
‑1‑
t22的表达。
[0065]
实施例6马铃薯来源的糖蛋白patatin
‑
1在乳酸克鲁维酵母中的表达
[0066]
按照实施例1～3相同的策略构建含糖蛋白patatin
‑
1编码基因的pklac1质粒，并将构建的重组质粒分别在乳酸克鲁维酵母gg799中表达。将重组乳酸克鲁维酵母在ypd培养基中培养一段时间，可检测到patatin
‑1‑
t22的表达。
[0067]
可选地，还可采用patatin
‑
1与伴侣蛋白共表达的方式，以有效提高patatin
‑
1的可溶性表达水平，便于后续蛋白的分离纯化。
[0068]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。