高比活植酸酶突变体的制作方法

1.本发明涉及蛋白质改造技术领域，具体涉及一种高比活植酸酶突变体及其应用。


背景技术：

2.植酸又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，在植物籽实中广泛存在，是植物性饲料中磷元素的主要储存形式，但是植酸磷不能直接被动物吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。因此，植酸被视为饲料中的有害成分，是一种抗营养因子。植酸酶具有消除植酸的抗营养作用，提高动物对日粮中蛋白质、矿物质等营养物质的利用率，减少动物粪便中磷对环境污染等独特的生理功能，越来越成为营养学领域的研究热点。同时，植酸酶作为一种外源饲料添加剂在动物营养中也得到了广泛应用。
3.植酸酶普遍存在于动物、植物和微生物中，是一类能够将植酸及其盐类催化水解成肌醇和磷酸的酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶作为环保促生长型饲料添加剂，可提高动物饲料中磷的利用率，减少动物养殖中磷对环境的污染和动物饲料中矿物质磷的添加量，同时能提高植物蛋白和植物饲料能量矿物质利用率，从而节约饲料资源，降低饲料成本，具有良好的应用前景。由于植酸酶在饲料行业的应用，既具有安全、环保、高效、经济的特点，又具有很好的社会生态环境效益，因此，在世界范围内被广泛推广使用。
4.最近研究发现，植酸酶能够在不影响肉鸡生产性能、屠体品质、保证钙磷平衡的前提下，明显减少日粮磷的排泄量；提高肉鸭的生长性能；提高猪生长性能,提高钙磷表观消化率；提高水产动物对营养物质的消化吸收率，促进水产动物的生长发育，提高其生产性能。
5.近年来，养殖畜牧业、水产行业的快速发展，大宗饲料原料出现了一定的短缺现象，而且无机磷对环境的污染也不容小觑，因此必须重视对植物磷的利用，其关键就在于酶制剂的应用。植酸酶由于具有独特而重要的生理功能，同时作为一种饲料添加剂在养殖畜牧业、水产行业中具有广泛的应用前景，也日益成为饲料界同行关注和研究的焦点。但是由于目前天然微生物表达的植酸酶产量较低、耐温性及稳定性差、生产成本高等缺点无法满足市场的需求。为得到产量高、耐温性及稳定性好、活性高的植酸酶，可通过用不同的方式解决：1.通过基因工程改良；2.优化表达系统；3.寻找更合适的宿主等获得更高效价的菌株。
6.本发明中我们开发了一个新的植酸酶基因，并通过蛋白质工程技术筛选了多个突变位点，可实现植酸酶的比活力力大幅度提高的目的。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种高比活植酸酶突变体及其重组表达菌株。所述突变体的生产成本大幅降低，可广泛应用于饲料领域。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明涉及一种植酸酶突变体，其包含与seq id no:2具有至少95%同一性的氨基
酸序列，且与seq id no:2相比在第165位和/或第287位上包含氨基酸的取代。
9.在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
10.在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
11.在本发明的一些实施例中，所述取代包括第165位氨基酸由v变为s和/或第287位氨基酸由a变为f。
12.本发明还涉及编码上述植酸酶突变体的dna分子。
13.本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达质粒。
14.本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。
15.将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的植酸酶突变体的比活力得到显著提升。
16.在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
17.本发明还提供了上述植酸酶突变体在饲料领域中的应用。
18.本发明以野生型植酸酶phy-a为基础，提供了包含v165s和/或a287f突变位点的突变体。与野生型植酸酶相比，包含v165s/a287f两点突变的植酸酶突变体phy-am的比活力提高了161.5%，高达408u/mg，取得了意料不到的技术效果。
19.综上，本发明提供的植酸酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
20.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
21.菌株与载体：大肠杆菌dh5α本公司保藏，毕赤酵母gs115、载体ppic9k、ppicza、amp、g418、zeocin购自invitrogen公司。
22.酶与试剂盒：dna聚合酶购买自takara公司，t4连接酶、限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
23.培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；lb amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；ypd zeocin培养基：ypd培养基加100μg/ml zeocin；酵母筛选培养基（md培养基）：1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油、2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4×
10-5
生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，0.5%甲醇。
24.下面结合具体实施方式，对本发明作进一步阐述。
25.实施例1、植酸酶基因的克隆和密码子优化申请人将来源于阿氏耶尔森氏菌（yersinia aldovae）的野生型植酸酶基因，命名为phy-a，其基因序列为seq id no:1，编码的氨基酸序列为seq id no:2。
26.以植酸酶phy-a的氨基酸序列为基础，根据毕赤酵母（pichia pastoris）的密码子偏好性对phy-a基因进行密码子优化，其优化后的核苷酸序列为seq id no:3，由华大基因公司全基因合成。
27.采用pcr反应克隆植酸酶基因phy-a片段，引物和反应条件如下：引物2(f)：gcgcgaattcatgactgttttgaaaaactctttgc；引物2(r)：taaagcggccgcttaaatatgacaggctggctcaatg。
28.pcr条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃保温10min。phy-a基因全长1326bp。
29.实施例2、高比活植酸酶突变体的筛选为了进一步提高植酸酶phy-a的比活力，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选；以植酸酶基因phy-a为模板，利用实施例1所述引物2(f)和引物2(r)，用genemorph ii随机突变pcr试剂盒（stratagene）进行pcr扩增，胶回收pcr产物，ecori、not i进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21(de3)中，涂布于lb amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mm iptg的lb amp培养基，37℃、220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。再离心去除菌体，将上清液进行植酸酶活力测定。
30.实验结果表明，有些突变对植酸酶phy-a的比活力没有影响，有些突变甚至使其比活力变得更低了。最终，申请人筛选得到比活力显著提高的突变位点：v165s、a287f。
31.将含v165s和a287f两点突变的植酸酶突变体命名为phy-am，其基因序列为seq id no:4，编码氨基酸序列为seq id no:5。
32.用引物2(f)和引物2(r)对phy-am进行pcr扩增，pcr条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃保温10min。phy-am的基因长度与phy-a基因相同，全长1326bp。
33.实施例3、重组表达植酸酶基因的毕赤酵母工程菌的构建1、重组质粒的构建将密码子优化后克隆得到的植酸酶基因phy-a和突变体基因phy-am，分别用限制性内切酶ecor i和not i进行双酶切，100 μl酶切体系如下：植酸酶基因phy-a（phy-am）的 pcr产物40 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、ecor i 5 μl、not i 5 μl、ddh2o 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
34.将表达载体ppic9k先用限制性内切酶ecor i进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体ppic9k 20 μl、10
×
h buffer 10 μl、ecor i 5 μl、ddh2o 65 μl。37℃酶切4 h
后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶not i进行单酶切，100 μl酶切体系如下：ppic9k回收片段 20 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、10
×
triton 10 μl、not i 5 μl、ddh2o 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
35.将经ecor i和not i双酶切的phy-a片段、phy-am片段分别与表达载体ppic9k连接，构建表达载体ppic9k-phy-a和ppic9k-phy-am。连接体系如下：表达载体ppic9k双酶切产物5 μl、基因双酶切产物3 μl、10
×
t
4 ligase buffer 1 μl、t
4 ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到lb amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒ppic9k-phy-a、ppic9k-phy-am。
36.2、转化与筛选将重组酵母表达质粒ppic9k-phy-a和ppic9k-phy-am分别用sal i进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素g418的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。
37.3、摇瓶发酵验证挑取单个多拷贝转化子分别接入bmgy培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入bmmy培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4天后，离心去除菌体，将上清液分别进行植酸酶酶活力和蛋白含量测定，计算比活力。
38.结果显示，在摇瓶水平下，表达植酸酶phy-a的转化子中发酵上清液的比活力最高达到156u/mg；而表达植酸酶突变体phy-am的转化子中发酵上清液的比活力最高达到408u/mg，比野生型提高了161.5%，取得了意料不到的技术效果。
39.本发明提供的v165s和a287f两个突变位点能显著提高植酸酶phy-a的比活力，从而有利于降低植酸酶的生产成本，促进其在饲料领域的广泛应用。
40.（一）植酸酶酶活检测方法（1）植酸酶酶活单位的定义在温度为37℃、ph为5.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/l植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以u表示。
41.（2）植酸酶酶活测定方法取甲、乙两支25ml比色管，各加入1.8ml乙酸缓冲液（ph 5.0）、0.2ml样品反应液，混匀，37℃预热5min。在甲管中加入4ml底物溶液，乙管中加入4ml终止液，混匀，37℃反应30min，反应结束后甲管中加入4ml终止液，乙管中加入4ml底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。
42.酶活x＝f
×
c/(m
×
30)。
43.其中：x——酶活力单位，u/g(ml)；f——试样溶液反应前的总稀释倍数；c——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，u；m——试样质量或体积，g/ml；30——反应时间。
44.（二）考马斯亮蓝法检测蛋白含量1、试剂（1）考马斯亮蓝g-250染色液：取考马斯亮蓝g-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。
45.2、标准曲线的绘制。
46.（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。管号123456样品（ml）00.10.20.30.40.5水（ml）2.01.91.81.71.61.5蛋白质含量（mg/ml）00.050.10.150.20.25
47.准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比色，记录吸光值。
48.（2）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染色能力强，比色杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。
49.3、样品的测定样品的准备：（1）液体样品：将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；（2）固体样品：准确称取1.0000g样品于100ml三角瓶中，用移液枪加入20ml去离子水，磁力搅拌10min，4000rpm离心10min，取上清进一步稀释测定蛋白含量，稀释方法参见液体样品。
50.样品检测：取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比色杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。
51.4、蛋白含量计算蛋白含量=x
×
稀释倍数
×
标样折算系数。
52.x：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）；标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。
53.（三）比活力的计算
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比活力 (specific activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单
位数，一般用u/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。
54.比活力计算公式：比活力（u/mg）=酶活（u/ml）/ 蛋白含量（mg/ml）。