GLP-1或其变体的羟基化检测方法与流程

glp-1或其变体的羟基化检测方法
技术领域
1.本发明涉及多肽检测技术领域，具体涉及一种glp-1或其变体的羟基化检测方法。


背景技术：

2.glp-1(glucagon-like peptide 1)是一种由肠道l细胞分泌的多肽类激素，可促进胰岛素的分泌，在血糖调节方面起着重要作用。但由于此多肽在体内极易被dpp-4酶降解，因此该多肽体内半衰期仅为4min左右，因此使用glp-1作降糖药需要考虑其半衰期。阿必鲁肽是由2个拷贝组成的重组融合蛋白，所述拷贝为30个氨基酸序列的经修饰的人胰高血糖素样肽1(glp-1，片段7-36(a8g))，其与重组人血清白蛋白连续地基因融合。每个glp-1序列已被修饰，其中用甘氨酸取代第8位的天然存在的丙氨酸，以赋予对二肽基肽酶iv(dpp-iv)介导的蛋白水解的抗性。阿必鲁肽的血糖调节活性部分由两个串联的glp-1多肽组成。
3.在使用中华仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell,cho cell)生产含有glp-1融合蛋白的过程中，glp-1融合蛋白的glp-1活性多肽部分被发现第28号位的赖氨酸(lysine,k)会发生羟基化，且比例不低，如下式所示：
[0004][0005]
glp-1上的赖氨酸发生羟基化修饰会影响产品的最终质量，因此在培养过程中需要对产品的羟基化含量比例进行监控和调节。要监控此位点的翻译后修饰，需要有准确可靠的定量分析方法。由于融合蛋白本身分子量可达70kda以上，而羟基化的改变仅为16da，分析上有相当的难度。
[0006]
目前主流的翻译后修饰定量分析方法需要借助高分辨率质谱来进行。先对纯化后的样品使用限制性蛋白酶进行酶切，然后使用高效液相色谱进行反相分离，得到良好分离的肽谱图后，然后搜寻含有/未含有翻译后修饰的肽段谱峰的质谱信号进行确证，然后通过公式：羟基化修饰比例％＝(含有羟基化的肽段峰面积)/(含有羟基化的肽段峰面积 未含有羟基化的肽段峰面积)
×
100％计算羟基化的量。
[0007]
对于50kda左右的融合蛋白而言，传统的肽谱图分析会产生相当数量的来自人血清白蛋白hsa部分的肽段谱峰，因此会对数据分析带来困扰，不能满足生产过程中及时监控glp-1羟基化修饰的需要。


技术实现要素：

[0008]
基于此，有必要针对上述问题，提供一种glp-1或其变体的羟基化检测方法，其能
够实现低成本、高检测效率和步骤简化地实现多肽的羟基化水平检测。本发明的目的在于提供一种glp-1或其变体的羟基化检测方法，包括以下步骤：
[0009]
将目标分析物glp-1或其变体与蛋白酶在溶剂中混合，进行酶切反应，得到seq id no:1所示序列的多肽，所述蛋白酶选自trypsin酶和lys-c酶中的任意一种或两种；
[0010]
对酶切反应的产物进行液相色谱或液-质谱联用分析；
[0011]
其中，glp-1的变体为在glp-1的基础上发生氨基酸的增加、缺失或替换后形成的多肽，glp-1的变体保留有seq id no:2或seq id no:3所示序列的多肽片段，并且在所述glp-1的变体中，与所述seq id no:2或seq id no:3所示的多肽片段的c末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸。本发明的目的是对glp-1或其变体中的赖氨酸的羟基化进行检测。通过对glp-1进行研究，筛选得到两种蛋白酶，trypsin酶和lys-c酶，其在合适的酶切条件，如酶的比例、酶切时间和温度下，能够识别xefiawlvk序列的多肽片段(trypsin酶识别的x为k或r，lys-c酶识别的x为k)，并对其进行酶切，切割得到efiawlvk序列的多肽片段。该切割得到的片段含有目标待检测的可能羟基化的赖氨酸，相对于原始长度的glp-1或其变体，切割后的多肽片段序列缩短，因此以切割后的多肽片段为基准进行检测更精确分辨序列中的赖氨酸是否发生羟基化以及羟基化的比例。本发明的方法可应用于监控或检测glp-1融合蛋白阿必鲁肽和度拉鲁肽的赖氨酸的羟基化水平。并且，本发明的检测前的处理方法简单，切割得到efiawlvk序列作为检测基准，不含二硫键，只需要测定该小片段，因此不需要进行还原处理，而且筛选得到的两种蛋白酶容易获得，可以节约成本、提高检测效率、简化样品处理步骤。
附图说明
[0012]
图1为本发明实施例1的阿必鲁肽样品羟基化分析液质分析图；
[0013]
图2为本发明实施例1的阿必鲁肽样品羟基化分析质谱图；
[0014]
图3为本发明实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切6小时的样品液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰efiawlvk片段，色谱峰2代表羟基化修饰efiawlvk片段；
[0015]
图4为本发明实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切6小时的对照液相图；
[0016]
图5为本发明实施例2的阿必鲁肽样品羟基化分析酶切16小时的样品液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰efiawlvk片段，色谱峰2代表羟基化修饰efiawlvk片段；
[0017]
图6为本发明实施例3的度拉鲁肽样样品羟基化分析液相图，色谱峰1代表未羟基化修饰efiawlvk片段，色谱峰2代表羟基化修饰efiawlvk片段。
具体实施方式
[0018]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0019]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相
关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0020]
本发明实施例提供一种glp-1或其变体的羟基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0021]
将目标分析物glp-1或其变体与蛋白酶在溶剂中混合，进行酶切反应，得到seq id no:1所示序列的多肽，所述蛋白酶选自trypsin酶和lys-c酶中的任意一种或两种；
[0022]
对酶切反应的产物进行液相色谱或液-质谱联用分析。
[0023]
其中，glp-1的变体为在glp-1的基础上发生氨基酸的增加、缺失或替换后形成的多肽，glp-1的变体保留有seq id no:2或seq id no:3所示序列的多肽片段。并且在所述glp-1的变体中，与所述seq id no:2或seq id no:3所示的多肽片段的c末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸，否则该蛋白酶无法识别并切断。
[0024]
seq id no:1为efiawlvk。
[0025]
seq id no:2为kefiawlvk。
[0026]
seq id no:3为refiawlvk。
[0027]
其中，lys-c酶只切kefiawlvk。
[0028]
trypsin酶可以切割xefiawlvk，x可以是k或r。
[0029]
本文使用的术语“变体”是分别不同于参考多肽、但保留基本性质(如保留参考多肽的生物学活性)的多肽。多肽的典型变体在氨基酸序列上与另一个参考多肽不同。通常，差异是有限的，这使得参考多肽和变体的序列在整体上非常类似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽在氨基酸序列中的不同可在于氨基酸的取代、添加、缺失中的一个或多个或任何组合。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的残基。多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或其可以是非已知天然存在的变体。多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成制备。变体还可以包括但不限于多肽或其片段，其具有一个或多个其氨基酸侧基的化学修饰。化学修饰包括但不限于：添加化学部分、产生新的键和去除化学部分。氨基酸侧基的修饰包括但不限于：赖氨酸-ε-氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的n-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化；以及谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括但不限于：去氨基、n-低级烷基、n-二-低级烷基和n-酰基修饰。末端羧基的修饰包括但不限于：酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。此外，一个或多个侧基或末端基团可以被蛋白质化学的普通技术人员已知的保护基团保护。
[0030]
如本文所用，当用于指多肽时，“片段”是具有与整个天然存在多肽的氨基酸序列部分相同(但不是全部相同)的氨基酸序列的多肽。片段可以是“独立的”，或被包含在较大的多肽内，其中它们作为单个连续区域在单个较大多肽中形成部分或区域。因此，glp-1的片段可以是“独立的”，或可以是遗传融合的，并且是较大氨基酸序列的一部分。举例来说，天然存在的glp-1的片段将包括天然存在的氨基酸1至36中的氨基酸7至36。此外，多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的变体。例如，包含天然存在的glp-1的氨基酸7-36的glp-1的片段也可以是在其部分序列内具有氨基酸取代的变体，例如在位置8的ala变为gly。
[0031]
在一些实施方式中，所述glp-1的变体具有如seq id no:4或seq id no:5所示的多肽片段。并且在所述glp-1的变体中，与所述seq id no:4或seq id no:5所示的多肽片段的c末端相连的第一个氨基酸不为脯氨酸。具有如seq id no:4所示的多肽片段的glp-1的
变体，如为阿必鲁肽。具有如seq id no:5所示的多肽片段的glp-1的变体，如度拉鲁肽。
[0032]
seq id no:4为hgegtftsdvssylegqaakefiawlvk。
[0033]
seq id no:5为hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvk。
[0034]
glp-1的其他变体可具有与seq id no:2或seq id no:3所示的多肽具有97％、94％、90％或87％序列同一性的多肽片段。
[0035]
在一些实施方式中，所述glp-1的变体为阿必鲁肽。其具有如下氨基酸序列序列：hgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrhgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl。
[0036]
在一些实施方式中，所述glp-1的变体为度拉鲁肽。其具有如下氨基酸序列序列：
[0037]
hgegtftsdvssyleeqaakefiawlvkgggggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg。
[0038]
本发明的目的是对glp-1或其变体中的赖氨酸的羟基化进行检测。通过对glp-1进行研究，筛选得到两种蛋白酶，trypsin酶和lys-c酶，其在合适的酶切条件，如酶的比例、酶切时间和温度下，能够识别xefiawlvk序列的多肽片段(trypsin酶识别的x为k或r，lys-c酶识别的x为k)，切割得到efiawlvk序列的多肽片段。该切割得到的该片段含有目标待检测的可能羟基化的赖氨酸，相对于原始长度的glp-1或其变体，切割后的多肽片段序列缩短，因此以切割后的多肽片段为基准进行检测更精确分辨序列中的赖氨酸是否发生羟基化以及羟基化的比例。本发明的方法可应用于监控或检测glp-1融合蛋白阿必鲁肽和度拉鲁肽的赖氨酸的羟基化水平。并且，本发明的检测前的处理方法简单，切割得到efiawlvk序列作为检测基准，不含二硫键，只需要测定该小片段，因此不需要进行还原处理，而且筛选得到的两种蛋白酶容易获得，可以节约成本、提高检测效率、简化样品处理步骤。
[0039]
本发明中，酶与蛋白样品的比例，以及酶切时间，都会影响酶切后所得片段的大小以及数量。片段越多越碎，液相分析出的杂峰也越多。当片段过多的时候，会对分析结果产生影响，因为碎片峰有可能会与目标峰进行重叠，从而影响结果的准确性，也会增加液相分离的难度。因此，酶切处理的理想的结果是所切片段越少越好，含有目标氨基酸的切割片段越短越好，含有目标氨基酸的切割片段与其他切割片段的长度差越大越好。
[0040]
在一些实施方式中，所述蛋白酶与所述目标分析物的质量比为1：(20～200)。
[0041]
优选的，所述蛋白酶与所述目标分析物的质量比为1：(20～100)。具体可以为1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100。
[0042]
在一些实施方式中，所述酶切反应的温度为15℃～30℃，所述酶切反应的时间为
acquity beh c18 column(2.1x150mm)等进行分析。所述流动相的流速可以为0.2ml/min～1ml/min。
[0052]
在一些实施例中，所述流动相的流速可以为0.2ml/min～0.3ml/min。
[0053]
以阿必鲁肽为例，其glp-1的活性部分肽段如下所示：
[0054]
hgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrhgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr
[0055]
trypsin可将上述肽段切成：
[0056]
hgegtftsdvssylegqaak
[0057]
efiawlvk(目标肽段)
[0058]
gr(极性太大不会在色谱柱保留)
[0059]
hgegtftsdvssylegqaak
[0060]
efiawlvk(目标肽段)
[0061]
gr(极性太大不会在色谱柱保留)
[0062]
从而达到分离的效果。
[0063]
lys-c酶也用于此融合蛋白的分析，其可将含glp-1的活性肽段切成：
[0064]
hgegtftsdvssylegqaak
[0065]
efiawlvk(目标肽段)
[0066]
grhgegtftsdvssylegqaak
[0067]
efiawlvk(目标肽段)
[0068]
grdahk(hsa融合部分肽段)
[0069]
以下为具体实施例。
[0070]
实施例1阿必鲁肽样品羟基化分析
[0071]
样品前处理步骤为：
[0072]
(1)取100μg纯化后的阿必鲁肽样品(浓度约1mg/ml)，使用zeba spin脱盐柱换液至0.1m nh4hco3溶液中(ph≈7.8)，得到约100μl样品。
[0073]
(2)加入用超纯水溶解的1μg/μl的promega trypsin gold胰蛋白酶1μl，使得酶与蛋白样品的比例为1：100，室温酶切6小时，加入10μl的10％甲酸终止酶切反应，13000
×
g离心5min后取上清装瓶上样。
[0074]
分析上样2μl样品，使用waters acquity hss t3 column(2.1
×
150mm)色谱柱进行uplc洗脱，洗脱液a相：0.1％甲酸-水，b相：0.1％甲酸-乙腈。
[0075]
洗脱梯度如下表1：
[0076]
表1
[0077]
time(min)flow rate(ml/min)a％b％00.21000350.24060400.20100500.2010050.10.21000600.21000
[0078]
对于阿必鲁肽而言，其glp-1的活性部分肽段如下所示：
[0079]
hgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgrhgegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr
[0080]
trypsin可将上述肽段切成：
[0081]
hgegtftsdvssylegqaak
[0082]
efiawlvk(目标肽段)
[0083]
gr(极性太大不会在色谱柱保留)
[0084]
hgegtftsdvssylegqaak
[0085]
efiawlvk(目标肽段)
[0086]
gr(极性太大不会在色谱柱保留)
[0087]
从而达到分离的效果。
[0088]
液质联用分析结果如图1所示。图1中(b)图为液相色谱图，(a)图为质谱总离子流图。其中(b)液相图保留时间为24.65min的物质对应(a)质谱图的24.75min物质，为羟基化修饰的efiawlvk肽段(所占比例如表2中1:t2&所示)；其中(b)液相图保留时间为25.00min的物质对应(a)质谱图的25.07min的物质，为无修饰的efiawlvk肽段(所占比例如表2中1:t2所示)。
[0089]
经计算，此羟基化修饰比例如下表2所示，大约占8％。
[0090]
表2
[0091][0092]
质谱信息：
[0093]
毛细管电压：3.00kv
[0094]
锥孔气流：50l/h
[0095]
锥孔电压：40v 脱溶剂气流：600l/h
[0096]
离子源温度：120℃
[0097]
脱溶剂气温度：400℃
[0098]
实验:mse
[0099]
离子源：esi采集时间：2-45min
[0100]
功能：mse
[0101]
扫描设置
[0102]
低质荷比(m/z)：100
[0103]
高质荷比(m/z):2000
[0104]
扫描时间：0.5s
[0105]
碰撞能：
[0106]
低能量：6ev
[0107]
高能梯度：23-55ev
[0108]
锥孔电压设定：使用方法设置。
[0109]
该肽段ms2离子碎片确证质谱图如图2所示。
[0110]
实施例2酶切条件分析
[0111]
实施例2与实施例1基本相同，区别仅在于室温酶切时间不同。室温为298k，即25
℃。一般使用25℃，100kpa作为实验室标准条件。
[0112]
室温酶切时间为6小时的液相分析结果如图3所示(画圈部分为羟基化修饰肽段efiawlvk及未修饰的目标肽段efiawlvk)。
[0113]
图4为室温酶切6h的buffer对照所得图样，5-35min无明显可见峰，说明trypsin在该条件下不会发生自酶切反应，对样品专属性鉴定无明显干扰。
[0114]
室温酶切时间为16小时的液相分析结果如图5所示，可以看到杂峰数量比图3多且更明显。
[0115]
实施例3度拉鲁肽样品羟基化分析
[0116]
样品前处理步骤为：
[0117]
(1)取100μg纯化后的度拉鲁肽样品(浓度约1mg/ml)，使用zeba spin脱盐柱换液至0.1m tris-hcl溶液中(ph≈7.8)，得到约100μl样品。
[0118]
(2)加入用超纯水溶解的1μg/μl的promega trypsin gold胰蛋白酶1μl，使得酶与蛋白样品的比例为1：100，室温酶切过夜16h，加入10μl的10％甲酸终止酶切反应，13000
×
g离心5min后取上清装瓶上样。
[0119]
分析上样2μl样品，使用waters acquity beh c18 column(2.1x150mm)色谱柱进行uplc洗脱，洗脱液a相：0.1％甲酸-水，b相：0.1％甲酸-乙腈。
[0120]
洗脱梯度如下表3：
[0121]
表3
[0122][0123]
经过trypsin切割后得到的主要肽段：
[0124]
hgegtftsdvssyleeqaak
[0125]
efiawlvk(羟基化修饰的肽段)
[0126]
gggggggsggggsggggsaesk(亲水的linker)。
[0127]
液相分析结果如图6所示。画圈处即羟基化修饰肽段efiawlvk及未修饰的目标肽段efiawlvk，说明该肽段也可适用于各种常见的反相c18色谱柱。
[0128]
实施例4酶切成本对比
[0129]
对比文件cn110865129a公开了一种度拉鲁肽中多种修饰水平的检测方法，一种基于酿脓链球菌的免疫球蛋白g降解酶(ides)酶切的度拉鲁肽中多种修饰水平的分析方法。该方法的特点是ides酶切需要过夜，并且需要进行还原反应。时间非常长，ides酶非常贵且非常稀有，也不易获得。并且该专利中描述到胰蛋白酶处理样品是无法监测到目标肽段的羟基化修饰。
[0130]
现对ides酶于trypsin酶的成本做对比。
[0131]
promega牌ides酶报价(5000unit)为$1,089.00/each。按1：100的处理方式，一瓶能做100个样品，平均每个样品$11，约66元/样。
[0132]
promega牌trypsin酶报价(100μg，大约1500unit)为$156.90/each。按1：100的处理方式一瓶大概能做100个样品，平均每个样品$1.6，约10元/样。
[0133]
综合考虑，trypsin价格更便宜。
[0134]
酶切ph的角度看，trypsin的范围在7.0-9.0的弱碱性范围都可以，一般7.5即可。ides的ph在5.1-7.6，最适范围在6.6。两者对比ph无明显优劣之分，均可通过正常缓冲液达到。
[0135]
相对于对比文件来说，本发明优点在于：1、样品前处理简便，时间短，不需要变性还原等步骤。2、本发明所使用的酶比对比文件中的酶更便宜。3.本分析方法能准确测出羟基化比例，克服技术偏见。
[0136]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0137]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。