一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法

1.本发明属于芽胞杆菌芽胞的制备领域，具体涉及一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法。


背景技术：

2.地衣芽胞杆菌是革兰氏阳性细菌，分泌能力强大，生长快，是重要的工业微生物菌种。芽胞的形成受发酵环境影响，常用的提高芽胞率方法可通过培养基优化和调控温度等来实现，如：发明专利cn102533579a公开了一种优化的产芽胞培养基配方：葡萄糖0.5～1.0％，玉米粉0.5～3％，麸皮0.1～1％，黄豆饼粉0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，无水碳酸钙0.05～ 0.3％。发明专利cn106947715a公开了一种高活菌数、高芽胞形成率的变温发酵培养方法 (34-37℃培养4h，35-40℃培养8h，37-40℃至结束)。发明专利cn112831437a公开了一种芽胞杆菌高芽胞形成率的发酵方法，具体为：发酵期中添加葡萄糖维持其浓度在1％至发酵结束，后将发酵液加热至50～80℃，保持15～60min，再冷却至室温。
3.芽胞的形成受环境因子诱发和基因的调控，培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成。因而，总体上对促进细胞生成芽胞而言，营养不足、温度逆境等因素是普遍常用或考虑的技术手段。
4.出于有机碳氮源成分对芽胞杆菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，发明专利 cn102533579a和cn112831437a采用了黄豆饼粉、麸皮和玉米粉、葡萄糖来笼统地满足芽胞生成的氮源和碳源需求。但是，这些有机氮源成分复杂、氮源和碳源用量较大，使得生产成本较高。另外，环境因子剧烈变化对芽胞杆菌生长而言也是一种逆境，因而，发明专利 cn106947715a和cn112831437a通过高温培养促进了芽胞的生成。
5.芽胞生成过程中会形成芽胞壁、皮层、芽胞衣等结构，其中富含蛋白质，其中芽胞衣中蛋白质含量占到了整个芽胞蛋白质量的50％，因而提高蛋白质的合成效率，比如增加氨基酸的和能量的供应等，对芽胞形成可能存在重要影响。但是这与本技术领域普遍接受的“培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成”的认知相矛盾。
6.虽然现有技术通过上述方法(培养基调整、营养匮乏、逆境等)可以提高芽胞生成效率，但是显然的，若能克服上述技术偏见，从增加氨基酸的和能量的供应等角度提高蛋白质的合成效率的角度进行优化，则可能使芽胞生成效率进一步地提高。
7.柠檬酸是微生物代谢重要的产物之一，作为络合/螯合剂广泛应用于有色金属工业；作为酸味剂、增溶剂、风味增进剂、调色剂等用于食品工业。柠檬酸还可以调控中心代谢途径关键酶如：抑制糖酵解途径中磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性、促进磷酸戊糖途径6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力(微生物学报，2004(5):627-630)。另外，柠檬酸本身具有一定抗菌作用，还被用作食品防腐剂列入食品添加剂名录，而且柠檬酸与过氧化氢联合使用，可以对杀灭细菌及其芽胞起到显著的协同增效作用(柠檬酸对低浓度过氧化氢杀灭细菌芽孢增
效作用的研究，袁国刚，中华预防医学会消毒分会学术年会，2014)。
8.但是，关于柠檬酸对芽胞形成的作用，或者是柠檬酸在芽胞形成中是否具有新的功能并没有相关报道。


技术实现要素：

9.本发明发现了柠檬酸具有促进细胞高密度发酵和调控芽胞形成效率的新功能：柠檬酸显著促进了三羧酸循环、电子传递链关键酶基因的表达量，提高了细胞能量代谢强度。进一步研究发现了出人意料的结果：柠檬酸还使得brnq(编码支链氨基酸转运蛋白)、vpr(编码丝氨酸蛋白酶)和yvbw(编码通用氨基酸转运酶)的表达量较未补料显著下调。同时，实现了地衣芽胞杆菌的高细胞密度和高芽胞量发酵，细胞数和芽胞数得到了极显著的提升，取得了极好的技术效果。也说明了芽胞杆菌高密度发酵工业通过提高豆粕等氮源供应强度来提高芽胞率的技术手段并不是合理科学的策略，提高芽胞率的限制因素不是氮源的供给强度，而是能量的合理供应。这既突破了本技术领域普遍接受的“培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成”的认知，又为芽胞杆菌发酵工业技术优化提供了明确的支撑。
10.本发明的目的在于提供一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法，其实质性特征是：不将柠檬酸作为常规意义上的络合/螯合剂(有色金属工业)、酸味剂、增溶剂、风味增进剂、食品防腐剂(食品工业)、过氧化氢杀灭芽胞增效剂等来使用，而是将柠檬酸作为代谢调控因子来使用。
11.本发明的目的通过下述技术方案实现：
12.柠檬酸在提高芽胞杆菌生物量和/或芽孢量中的应用。所述的芽胞杆菌包括地衣芽胞杆菌芽胞。
13.一种地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法，为在发酵培养地衣芽胞杆菌的过程中加入柠檬酸。
14.进一步地，所述的地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法，为在地衣芽胞杆菌发酵15h时，开始无菌流加柠檬酸溶液至发酵结束前4-6h。
15.更进一步地，所述的地衣芽胞杆菌高细胞密度和/或高芽胞量的发酵方法，包括以下步骤：
16.(1)地衣芽胞杆菌种子扩大培养；(2)将种子接种到发酵罐中进行发酵培养，在发酵15h 时，开始无菌流加柠檬酸溶液至发酵结束前4-6h。地衣芽胞杆菌种子扩大培养和发酵培养按常规操作进行。
17.上述发酵方法中，柠檬酸质量优选占发酵液质量的1.5％。
18.与现有技术相比本发明具有补料成分更简单、明确、原料易购、成本低、补加方法明确、操作可控性高、适用于发酵生产等优点。
附图说明
19.图1是柠檬酸对地衣芽胞杆菌icd、cyda、citz基因表达的影响图。
20.图2是柠檬酸对地衣芽胞杆菌brnq、vpr、yvbw基因表达的影响图。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
22.实施例1
23.(1)发酵培养基(g/l)：玉米淀粉25，豆粕30，葡萄糖10，蛋白胨5，k2hpo
4 2。试管斜面培养基以及茄子瓶斜面培养基：lb培养基，琼脂2％。种子摇瓶培养基(g/l)：玉米淀粉15，豆粕15，葡萄糖5，蛋白胨5，k2hpo
4 2。
24.(2)种子液扩大培养：将-80℃冰箱的甘油管保存的地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis) 菌种转接试管斜面，37℃培养36h活化。将活化后的菌种转接至新鲜茄子瓶斜面，37℃培养 24h，再向茄子瓶中加入50ml无菌水，制备菌悬液后接种种子摇瓶，37℃、200rpm培养 24h，合瓶备用。
25.(3)发酵培养：发酵培养基体积按发酵罐容积的70％(50l)计，121℃，蒸汽灭菌30 min。发酵条件：将种子液按10％的接种量接种，在35℃、转速500r/min、通风量1.0m3/h 下培养至发酵结束。
26.地衣芽孢杆菌细胞的生长过程中细胞数(生物量)和芽孢数的情况为：发酵培养24h芽胞数为133
×
108cfu/ml。30h细胞数(生物量)达到峰值(296
×
108cfu/ml)，但此时芽胞率仅有28％。30h后，细胞数和芽胞数大幅下降，33h分别为240
×
108cfu/ml和83
×
10
8 cfu/ml；36h分别为248
×
108cfu/ml和65
×
108cfu/ml。
27.实施例2
28.(1)培养基：同实施例1。
29.(2)种子液扩大培养：同实施例1。
30.(3)发酵培养：同实施例1，发酵15h开始补入柠檬酸溶液，使其在发酵液中最终质量浓度1.5％。发酵培养30h细胞数达到307
×
108cfu/ml，与实施例1接近。30h的芽胞数为 289
×
108cfu/ml，芽胞率94.1％，较实施例1提高了236％。出人意料的是30h以后，细胞数和芽胞数继续增长，33h分别为380
×
108cfu/ml和320
×
108cfu/ml。36h分别达到 420
×
108cfu/ml和400
×
108cfu/ml，分别比本实施例30h的细胞数和芽胞数提高36.8％和 38.4％。这个令人意外的结果已远非实施例1所能比拟。
31.同时，通过荧光定量pcr检测实施例2和实施例1中发酵27h时细胞中相关基因的表达情况，各基因所用引物序列如表1所示，基因表达差异结果如图1和图2所示。
32.表1扩增引物列表
[0033][0034]
三羧酸循环关键酶柠檬酸合成酶(编码基因citz)表达量与实施例1接近，而异柠檬酸脱氢酶(编码基因icd)表达量提高162％。与能量代谢密切相关的电子传递链组分细胞色素氧化酶基因cyda表达量提高87％。说明柠檬酸显著增强了三羧酸循环、电子传递链关键酶基因的表达量，促进了细胞能量和碳代谢强度(图1)。
[0035]
出人意料的是：brnq(编码支链氨基酸转运蛋白)、vpr(编码丝氨酸蛋白酶)和yvbw (编码通用氨基酸转运酶)表达量较对照(实施例1)分别下调88％、18％和65％。这些基因表达的差异实在让人感到惊讶。也说明培养条件下，氨基酸不是细胞生长和芽孢形成的限制因素(图2)。也说明了芽胞杆菌高密度发酵工业通过提高豆粕等氮源供应强度来提高芽胞率的技术手段并不是合理科学的策略，提高芽胞率的限制因素不是氮源的供给强度，而是能量的合理供应。这既突破了本技术领域普遍接受的“培养基中碳氮源的耗尽、磷酸盐缺乏使细胞的能量水平下降，会促进芽胞的形成”的认知，又为芽胞杆菌发酵工业技术优化提供了明确的支撑。
[0036]
实施例3
[0037]
(1)培养基：同实施例1。
[0038]
(2)种子液扩大培养：同实施例1。
[0039]
(3)发酵培养：发酵条件同实施例1，与发酵15h开始补入乳酸溶液，使其最终在发酵液中的质量浓度为0.7％。发酵培养24h细胞数181
×
108cfu/ml，后下降，27～30h维持在 160
×
108cfu/ml，后进行二次生长，33～36h维持在207
×
108cfu/ml左右，较实施例1(30 h，296
×
108cfu/ml)减少30.1％。33h芽胞数达到峰值174
×
108cfu/ml，但其芽胞稳定性较差，至36h芽胞数降为137
×
108cfu/ml，此时芽胞率仅为66.8％。
[0040]
虽然乳酸与柠檬酸均为常见的有机酸，但是显然，柠檬酸对细胞生长和芽胞形成
均存在积极地促进作用。而流加乳酸对细胞生长具有两面性，一方面它抑制甚至引起细胞在24-27h 之间自溶死亡，另一方面，细胞经过艰难适应期后才于30h开始二次生长。乳酸对芽胞形成有一定的促进作用，但其效果与实施例2中柠檬酸的调控作用完全不同，不同有机酸之间不存在启发性。
[0041]
实施例4
[0042]
(1)培养基：同实施例1。
[0043]
(2)种子液扩大培养：同实施例1。
[0044]
(3)发酵培养：发酵条件同实施例1，与发酵15h匀速补入葡萄糖溶液，使其最终在发酵液中的质量浓度为1.5％。发酵培养24h细胞数由120
×
108cfu/ml持续增长至30h达到峰值(146
×
108cfu/ml)，较实施例1的30h的峰值细胞数减少一半。33h芽胞数仅有126
×
10
8 cfu/ml，较实施例1(24h，133亿个/ml)减少5.5％。说明流加葡萄糖抑制了菌体生长，对芽胞生成没有促进作用。虽然葡萄糖作为碳源能加强地衣芽胞杆菌的碳代谢和能量代谢，但是显然，它并不具备等质量浓度柠檬酸的促进细胞生长和芽孢形成的调控功能。说明：就碳源促进细胞能量以及生长、代谢影响而言，不同碳源之间不存在相互启发性。
[0045]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。